劉元嫄, 程金平, 高利利, 徐 瑋, 吳浩東

（上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200240）

軟骨藻酸多克隆抗體的制備

劉元嫄, 程金平, 高利利, 徐 瑋, 吳浩東

（上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200240）

為建立軟骨藻酸（DA）的免疫檢測(cè)法, 本研究采用活潑酯法將 DA與載體蛋白 KLH（BSA）偶聯(lián)形成完全免疫抗原（包被抗原）, 并通過紫外光譜掃描證明偶聯(lián)成功與否。用完全免疫抗原 DA-KLH對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫, 間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明偶聯(lián)成功, 經(jīng)過19周免疫后血清效價(jià)達(dá)到1:1600, 純化后獲得效價(jià)為1:800的多克隆抗體, 同時(shí)也間接證明了合成的完全抗原具有免疫原性,為以后建立免疫分析法奠定了基礎(chǔ)。

軟骨藻酸; 多克隆抗體; 活潑酯法

軟骨藻酸（Domoic Acid, DA）是赤潮毒素失去記憶性貝毒（Amnesic Shellfish Poisoning, ASP）的主要成分。中毒后可引起腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重者可致意識(shí)混亂、記憶喪失。DA最早于1958年從樹枝軟骨藻（Chondria armata） 中分離, 并于隨后相繼分離了A-H八種異構(gòu)體[1]。其中異構(gòu)體A、B、C的毒性遠(yuǎn)低于DA本身[2]。DA主要通過與谷氨酸受體結(jié)合引發(fā)一系列生化反應(yīng), 從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及細(xì)胞死亡[3]。自加拿大愛德華王子島爆發(fā)了因食用被DA污染的紫貽貝而導(dǎo)致人類中毒事件后, 引起了人們對(duì)貝類產(chǎn)品中 ASP檢測(cè)的重視, 各國(guó)先后制定了 DA的安全限量為20 μg/g貝肉[4]。目前DA較為普遍的檢測(cè)方法有小白鼠生物檢測(cè)法、HPLC-UVD法及免疫檢測(cè)法。小白鼠生物法簡(jiǎn)單易行, 但其只能毒素的整體水平、精確度低、檢測(cè)限高、易受其他種類毒素干擾、無(wú)法滿足人們對(duì)食品安全的檢測(cè)需求;HPLC-UVD法作為水產(chǎn)及水產(chǎn)加工品專業(yè)委員會(huì)（Codex Committee on Fish and Fishery Products,CCFFP）推薦的方法[5]雖然具有靈敏度高、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn), 但因其儀器昂貴、對(duì)分析人員的要求高、前處理繁瑣而不適用于基層檢測(cè)單位對(duì)大量樣品的分析。而免疫檢測(cè)如ELISA法, 則兼具檢測(cè)便利快速,精確度較高等特點(diǎn)而已被廣泛用于環(huán)境污染物及農(nóng)藥獸藥殘留的檢測(cè)[6-8]。由于DA分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單無(wú)法刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體, 因此目前為止還沒有成熟的商品化檢測(cè)試劑盒。作者采用活潑酯法將 DA與載體蛋白偶聯(lián), 成功制備了完全抗原并免疫新西蘭兔獲得多克隆抗體, 為建立 DA檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品

軟骨藻酸（DA）購(gòu)自ALEXIS公司, 純度為98%;牛血清白蛋白（BSA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、弗式完全佐劑（FCA）、弗式不完全佐劑（FIA）、二甲基亞砜（DMSO）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基 碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）均購(gòu)自 Sigma公司; N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、Tween-20、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、96孔酶標(biāo)板、透析袋（截留分子量 8000）均購(gòu)自上海生工; 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司; Millipore超濾管（截留分子量10000）; 無(wú)水乙醇、檸檬酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、濃硫酸等均為分析純, 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì); Multiskan Mk 3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）; 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 GNP-9050型;HANGPING FA2004電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）; 單通道微量移液器（Enppendorf）; 12通道微量移液器（MedDragon）;

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔數(shù)只, 雌性, 體質(zhì)量1.8～2 kg, 購(gòu)自上海陳行實(shí)驗(yàn)用兔有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 完全免疫抗原與包被抗原的合成

1 mg DA溶于少量溶劑中（DMSO:水=1:9）, 加入0.8 mg EDC·HCl（10 mg/mL）、1.2 mg NHS（20 mg/mL）及少量反應(yīng)緩沖液（0.1 mol/L PBS, pH7.0）, 置于25 ℃反應(yīng)2 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱內(nèi)反應(yīng)過夜。加入用稀釋緩沖液（0.01 mol/L PBS, pH7.0）溶解的KLH或BSA 2 mg, 并補(bǔ)加少量反應(yīng)緩沖液, 置于25 ℃反應(yīng)3 h后,轉(zhuǎn)移入超濾管4500 r/min離心15 min, 除去未反應(yīng)完的小分子。適度稀釋后, 取少量反應(yīng)物用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)、剩余藥品分裝后于?20℃保存。

1.2.2 抗體的制備

新西蘭白兔在動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性馴養(yǎng)一周后, 選擇身體健康的白兔, 從耳靜脈抽取2～4 mL血, 分離陰性血清, ?20 ℃凍存?zhèn)溆?。一周后進(jìn)行免疫, 首免用200 μg DA-KLH, 同時(shí)分別用KLH和生理鹽水作為免疫原作為對(duì)照。將偶聯(lián)物稀釋至 0.5 mL, 采用注射器雙推法, 與等體積弗式完全佐劑充分乳化, 頸背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射。三周后進(jìn)行二免, 劑量方法同首免, 與弗式不完全佐劑混合乳化。以后以相同劑量與方法每隔兩周免疫一次。從三免開始, 每次免疫一周后, 耳靜脈取血2 mL, 測(cè)定效價(jià)。待效價(jià)達(dá)到一定程度后, 用等體積的稀釋緩沖液稀釋后, 耳靜脈注射加強(qiáng)免疫。一周后心臟取血, 37 ℃放置1 h, 4 000 r/min、4 ℃離心15 min分離血清。采用辛酸-硫酸銨法對(duì)抗血清純化, 用0.01 mol/L PBS（pH7.4）透析3天除鹽, 用少量0.01 mol/L PBS稀釋后分裝, ?20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體效價(jià)的測(cè)定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗體效價(jià)。用DA-BSA作包被抗原, 以碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）做梯度稀釋, 每孔 100 μL, 4 ℃包被過夜; 棄去殘液后,每孔加 200 μL PBS-T（含 0.05% Tween-20 的 0.01 mol/L PBS溶液, pH 7.4）, 振蕩洗滌3次, 每次3 min;每孔加200 μL 封閉液（含0.05% BSA的0.01 mol/L PBS）, 37 ℃封閉2 h; 拍干板內(nèi)液體后, 加梯度稀釋的血清, 每孔100 μL, 37 ℃孵育1 h; 洗板3次; 加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗, 每孔100 μL, 37 ℃孵育1 h; 洗板5次; 每孔加100 μL TMB-H2O2顯色液（ pH 5.0）, 顯色10分鐘后, 每孔加50 μL 2 mol/L H2SO4終止液, 用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm及630 nm處的光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原的偶聯(lián)與鑒定

采用活潑酯法[7,9,10]將DA上的羧基先與NHS及EDC反應(yīng), 先生成酯類中間產(chǎn)物, 然后與載體蛋白上的自由氨基反應(yīng)形成由酰胺鍵相連的偶聯(lián)物。反應(yīng)方程式如圖1。

將合成完的偶聯(lián)物、DA、KLH、BSA稀釋, 用紫外光譜進(jìn)行特征掃描。如圖2、圖3可見DA的特征吸收峰在242 nm處, 載體蛋白KLH及BSA的特征吸收峰在280 nm處, 而合成的偶聯(lián)物的紫外光譜掃描的特征譜線與DA、KLH及BSA的譜線的峰型及最大吸收峰有較大的區(qū)別, 可定性證明活潑酯法能成功地將載體蛋白和DA進(jìn)行偶聯(lián)。

圖1 DA與載體蛋白的偶聯(lián)Fig. 1 Reactions between DA and carrier protein

2.2 抗體效價(jià)的測(cè)定

以 DA-BSA為包被抗原, 用棋盤法測(cè)定血清效價(jià)。P / N≥2.1為陽(yáng)性判斷終點(diǎn), 以判為陽(yáng)性的最高稀釋倍數(shù)為終點(diǎn)效價(jià), 免疫 8次后, 效價(jià)變化如圖4。在八次免疫過后, 注射DA-KLH的白兔血清中抗體效不再增加, 滴度為 1:1600, 間接證明了合成的完全免疫抗原具有一定的免疫原性。經(jīng)辛酸-硫酸銨二步法純化后抗體各個(gè)滴度的吸光度值如表1所示。純化后抗體效價(jià)為1:800, 比純化前下降一個(gè)滴度。

3 討論

本研究采用了活潑酯法將DA與載體蛋白偶聯(lián),通過紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物與單體的譜圖有較大地差異, 故而定性地證明了成功合成了免疫抗原DA-KLH及包被抗原DA-BSA, 并使用DA-KLH對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫。經(jīng)過八次共19周的免疫, 用間接 ELISA法測(cè)定效價(jià), 效價(jià)達(dá)到 1:1600, 純化后獲得效價(jià)為1:800的抗體。

圖2 完全免疫抗原DA-KLH紫外光譜掃描圖Fig. 2 UV absorption of DA-KLH

圖3 包被抗原DA-BSA紫外光譜特征掃描圖Fig. 3 UV absorption of DA-BSA

圖4 血清中抗體效價(jià)的變化Fig. 4 Rabit serum titers determined by indirect ELISA

在誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體的過程中影響因素頗多, 除了外部環(huán)境、動(dòng)物自身的免疫應(yīng)答能力等因素外,抗原本身的免疫原性及免疫特性最為重要。小分子半抗原的免疫特性的好壞主要取決于基團(tuán)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、結(jié)構(gòu)中環(huán)的數(shù)目、雜原子的數(shù)目和結(jié)構(gòu)的不均一性[11]。而半抗原本身又不具備免疫原性, 必須與載體蛋白偶聯(lián)后才可刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體。DA上帶有3個(gè)羧基均可與載體蛋白偶聯(lián), 故偶聯(lián)的時(shí)候具有較大的隨機(jī)性, 易將雜環(huán)包裹從而降低特性。但由于DA價(jià)格昂貴,不適于對(duì)其進(jìn)行基團(tuán)修飾, 因此根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10], 進(jìn)行直接偶聯(lián), 同時(shí)對(duì)其方法做了適當(dāng)改進(jìn), 使反應(yīng)中盡可能得不損失抗原。免疫后結(jié)果如圖4及表1, 實(shí)驗(yàn)表明, 選擇了免疫原性較好的KLH作為免疫抗原的載體蛋白, 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)免疫, 能夠刺激動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)DA的抗體, 利用間接ELISA法檢測(cè)的效價(jià)也尚可, 純化后得到可以使用的抗體, 為今后進(jìn)一步建立ELISA檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

表1 純化后抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Tab. 1 Titers of purified serum by different immunogens

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Received: Feb., 22, 2010

Key words:domoic acid; polyclonal antibody; activation ester method

Abstract:To develop an immunoassay of domoic acid （DA）, DA was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH）or bovine serum albumin （BSA） by the activation ester method. The conjugates were characterized by UV absorption. Polyclonal antibodies for domoic acid were generated from rabbits after the animals had been immunized by DA-KLH for 19 weeks. The titer of antiserum was 1:1600, detected by an indirect ELISA. After purification, the titer of antiserum became 1:800. DA-KLH was proved to be a suitable immunogen to prepare antibodies against DA.

（本文編輯:梁德海）

Preparation of polyclonal antibodies against domoic acid

LIU Yuan-yuan, CHENG Jin-ping, GAO Li-li, XU-Wei, WU Hao-dong

（School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China）

R392-33

A

1000-3096（2010）12-0067-03

2010-02-22;

2010-06-13

上海科委科技攻關(guān)項(xiàng)目（08DZ1206302）

劉元 （1985-）, 女, 碩士研究生, 主要研究方向?yàn)榄h(huán)境健康, Email: yy_liu@sjtu.edu.cn; 程金平, 通信作者, 博士, 副教授,電話: 021-54742823, 13916873206, E-mail: jpcheng@sjtu.edu.cn