劉澤浩, 李 捷, 楊學(xué)玲, 王海艷, 李永強(qiáng), 張素萍, 徐鳳山

（1. 青島理工大學(xué), 山東 青島 266033; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)局, 天津 寶坻 301800）

中國(guó)北方沿海潮間帶常見鏡蛤的種類

劉澤浩1, 李 捷1, 楊學(xué)玲3, 王海艷2, 李永強(qiáng)1, 張素萍2, 徐鳳山2

（1. 青島理工大學(xué), 山東 青島 266033; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)局, 天津 寶坻 301800）

在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（28S rRNA、COI部分序列）分析的基礎(chǔ)上, 對(duì)我國(guó)北方典型海區(qū)遼寧丹東, 山東煙臺(tái)、威海, 江蘇連云港的常見鏡蛤進(jìn)行了取樣和分類地位的研究。結(jié)果表明: 日本鏡蛤（Dosinia japonica）、薄片鏡蛤（Dosinia corrugata）和餅干鏡蛤（Dosinia biscocta）為我國(guó)北方沿海潮間帶常見且大量分布的種類, 其中餅干鏡蛤與日本鏡蛤的遺傳距離比較接近（以較高支持率聚為一支）。連云港的餅干鏡蛤以及丹東的薄片鏡蛤的不同個(gè)體間存在差異, 對(duì)這兩地區(qū)的樣品還有待作進(jìn)一步的研究。

鏡蛤（Dosinia）; 分類; COI; 28S rRNA

鏡蛤?qū)儆谲涹w動(dòng)物門, 雙殼綱, 簾蛤目, 簾蛤科,鏡蛤亞科, 鏡蛤?qū)賉1], 棲息于潮間帶至潮下帶淺海, 在中國(guó)南、北沿海均有分布, 可食用, 具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。文獻(xiàn)記載中國(guó)北方常見鏡蛤有日本鏡蛤（Dosinia japonica）、薄片鏡蛤（Dosinia corrugata）、餅干鏡蛤（Dosinia biscocta）、高鏡蛤（Dosinia altior）、凸鏡蛤（Dosinia derupta）[1～4]。由于鏡蛤外殼形態(tài)相近, 通常以外套竇和小月面的形狀為其主要分類特征, 種類鑒定困難。同物異名和異物同名現(xiàn)象比較嚴(yán)重。專家對(duì)于中國(guó)北方沿海鏡蛤種類的報(bào)道有所不同: 莊啟謙[2]和齊鐘彥等[3]報(bào)道中國(guó)北方沿海的鏡蛤種類有: 凸鏡蛤（D. derupta）、日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D.corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D. altior）;徐鳳山、張素萍記述中國(guó)北方海域的鏡蛤種類有: 日本鏡蛤（D. japonica）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D.altior）、薄片鏡蛤（D. corrugata）[1]。

本研究對(duì)遼寧丹東, 山東煙臺(tái)、威海, 江蘇連云港 4個(gè)海區(qū)潮間帶的鏡蛤進(jìn)行取樣, 并對(duì)其形態(tài)特征和28S rRNA、線粒體COI部分序列進(jìn)行分析, 認(rèn)為目前中國(guó)北方沿海潮間帶近海海域主要鏡蛤種類有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）和餅干鏡蛤（D. biscocta）。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究用的鏡蛤分別采自中國(guó)遼寧省的丹東、山東省的煙臺(tái)和威海、江蘇省的連云港 4個(gè)海區(qū)的潮間帶（表 1, 圖 1）。形態(tài)上初步鑒定為日本鏡蛤（D.japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D.biscocta）。樣品采集后活體運(yùn)回, 立即解剖, 取出閉殼肌、足、外套膜, 保存于96%的酒精中, 以備實(shí)驗(yàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

取30 mg保存于96%酒精中的樣品閉殼肌組織,基因組 DNA的提取采用 TIANGEN海洋動(dòng)物組織DNA提取試劑盒。獲得的DNA樣品用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并將一部分模板稀釋到 100 mg/L留作實(shí)驗(yàn)用, 其余未稀釋的模板母液放于－20°C冰箱中備用[6～12]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD公司生產(chǎn)的MyCyclerTM擴(kuò)增儀上進(jìn)行。用于28S rRNA片段擴(kuò)增的引物為:28SD1F（5′-GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3′）和 28SD6R（5′-CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3′）[13]; 用于COI基因片段擴(kuò)增的引物為: COIL1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和 COIH-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[14]。50 μL 的 PCR 擴(kuò)增體系為: 1.5mmol/L MgCl2;200 μmol/L dNTP; 0.2 μmol/L 引物; 100 ng 模板DNA; 2U Taq 酶; 5 μL 的 10×buffer[5]。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下: 94°C 預(yù)變性 4 min; 94°C 變性 40 s,60°C（28S rRNA）/48°C（COI）退火 40 s, 72°C 延伸 1 min 15 s, 共 30 個(gè)循環(huán); 最后 72°C 延伸 10 min[8～12]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化回收、測(cè)序。

表1 取樣地點(diǎn)、環(huán)境及測(cè)序樣品數(shù)Tab. 1 Locations, habitats numbers of samples

圖1 鏡蛤取樣地點(diǎn)的全國(guó)分布圖Fig. 1 A map of China’s coast showing collecting sites ofDosiniaand related sites in our paper

1.2.3 序列分析

用BioEdit軟件并結(jié)合DNA正反向序列圖譜對(duì)DNA序列進(jìn)行校正。用 Philip3.5軟件用鄰接法（neighbor-joining method, NJ）和最大簡(jiǎn)約法（maximal parsimony method, MP）建立系統(tǒng)發(fā)生樹[5～12]。系統(tǒng)樹做Bootstrap檢驗(yàn)[5]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤形態(tài)分析

對(duì)采自不同海區(qū)的鏡蛤進(jìn)行形態(tài)分析, 發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)鏡蛤的形態(tài)有所差異。連云港贛榆地區(qū)鏡蛤的外套竇有所差異, 有的個(gè)體外套竇窄且先端尖,有的個(gè)體外套竇寬且先端鈍圓（圖 2b）。威海與海陽地區(qū)鏡蛤的形態(tài)差異較小。在本研究中丹東地區(qū)鏡蛤的鉸合齒、小月面存在形態(tài)差異（圖2c, 圖6）。

圖2 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics ofDosiniasfrom different intertidal areas

2.2 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤的分子系統(tǒng)學(xué)分析

對(duì)鏡蛤進(jìn)行28S rRNA、COI序列測(cè)定, 測(cè)得單倍型用D. corrugate（DDC）、D. japonica（WH/HY）、D. corrugate（DDA）、D. corrugate（DDB）、D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）表示。

對(duì)本研究測(cè)得的每個(gè)單倍型和 Genbank中已登載的日本鏡蛤（D. japonica,DQ343851）、青蛤（Cyclina sinensis,DQ343849）序列進(jìn)行聚類分析,青蛤（C.sinensis,DQ343849）作為外群。所測(cè)得序列用Philip3.5軟件分析, 用最大簡(jiǎn)約法（MP）和相鄰法（NJ）進(jìn)行聚類分析得到的 MP樹和 NJ樹表明（圖3和圖4）: 海陽地區(qū)（D. japonica（HY））、威海地區(qū)（D. japonica（WH））的鏡蛤和 Genbank中登載的（D. japonica,DQ343851）聚為一支; 威海地區(qū)（D. corrugata（WH））、丹東地區(qū)（D. corrugata（DD））和贛榆地區(qū)（D. corrugata（GY））的鏡蛤聚為一支。贛榆地區(qū)（D.biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB））鏡蛤聚為一支。

圖3 根據(jù)28S rRNA部分序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的NJ樹（A）和MP樹（B）Fig. 3 Phylogenetic trees based on neighbour-joining（A）and maximal parsimony（B） analysis of partial 28S rRNA sequence using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

威海、丹東、贛榆地區(qū)鏡蛤D. corrugate（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為 0～0.1%。威海、海陽地區(qū)鏡蛤D. japonica（WH/HY）之間遺傳距離為 0, 與Genbank登載的D. japonica（DQ343851）遺傳距離為0.1%。贛榆地區(qū)鏡蛤D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為 0.1%。D. japonica（WH/HY）與D. corrugata（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為 1.17%～1.27%,D. japonica（WH/HY）與D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為0.39%～0.49%,D. corrugata（WH/DD/GY）與D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為1.57%～1.79%（表2）。

D. corrugata（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為0～1.01%,D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為 0.17%,D. japonica（WH）、D. japonica（HY）之間的遺傳距離為 0～0.17%。D. corrugata（WH/DD/GY）與D. biscocta（GY）的遺傳距離為 16.78%～17.53%,D. corrugata（WH/DD/GY）與D. japonica（WH/HY）的遺傳距離為 16.09%～16.94%,D. biscocta（GY）與D. japonica（WH/HY）的遺傳距離為 12.00%～12.41%[5]（表3）。

圖4 利用COI部分序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的NJ樹（A）和MP樹（B）Fig. 4 Phylogenetic trees based on neighbour-joining （A）and maximal parsimony （B） analysis of partial mtCOI sequences using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

3 討論

3.1 中國(guó)北方沿海潮間帶常見鏡蛤的種類

文獻(xiàn)記載中國(guó)北方沿海潮間帶常見鏡蛤有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D. altior）[1～3]。凸鏡蛤主要分布在中國(guó)各海區(qū)的近岸淺水區(qū)[1], 本研究未涉及凸鏡蛤（D. derupta）的分類。本研究對(duì)遼寧丹東、山東煙臺(tái)、威海、江蘇連云港 4個(gè)海區(qū)潮間帶常見鏡蛤的形態(tài)和28S rRNA、線粒體COI部分序列進(jìn)行分析, 認(rèn)為中國(guó)北方沿海潮間帶主要鏡蛤種類有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）。分子系統(tǒng)樹表明, 威海、海陽地區(qū)鏡蛤D. japonica（WH）、D. japonica（HY）與 Genbank中登載的Dosinia japonica聚為一支, 遺傳距離比較小, 為日本鏡蛤; 丹東、贛榆地區(qū)鏡蛤D. corrugata（DDA）、D. corrugata（DDB）、D. corrugata（DDC）、D. corrugata（GY）聚為一支, 形態(tài)與薄片鏡蛤相似,為薄片鏡蛤; 贛榆地區(qū)鏡蛤D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）聚為一支, 形態(tài)與餅干鏡蛤相似,為餅干鏡蛤。分析表明餅干鏡蛤（D. biscocta）和日本鏡蛤（D. japonica）遺傳距離比較小, 二者之間有較近的親緣關(guān)系。本研究中未發(fā)現(xiàn)高鏡蛤（D. altior）的樣品, 至于高鏡蛤在中國(guó)北方潮間帶目前是否存在？其分類地位如何？這些還值得進(jìn)一步研究。

表2 根據(jù)28S rRNA部分序列數(shù)據(jù)及Genbank登錄D. japonica、C. sinensis序列構(gòu)建的遺傳距離Tab. 2 Pairwise sequence divergence for partial 28S rRNA fragments of tested samples and reference species,D. japonica and C. sinensis

表3 根據(jù)COI部分序列數(shù)據(jù)及Genbank登錄Cyclina sinensis序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的Pairwise遺傳距離Tab. 3 Pairwise sequence divergence for partial COI fragments of tested samples and reference species

3.2 中國(guó)北方沿海潮間帶常見鏡蛤的形態(tài)學(xué)分析

日本鏡蛤?yàn)橹袊?guó)北方沿海潮間帶常見種類[1～3]。本研究結(jié)果表明, 日本鏡蛤（D. japonica（WH）、D. japonica（HY））不同個(gè)體間形態(tài)差異和分子差異比較小, 其中28S序列分析中只出現(xiàn)一個(gè)單倍型, COI序列分析中出現(xiàn)2個(gè)單倍型。

餅干鏡蛤在所測(cè)樣品的28S rRNA、COI序列中均出現(xiàn)兩個(gè)單倍型D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）, 通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 兩個(gè)單倍型個(gè)體外套竇存在差異（圖5）。有的個(gè)體外套竇窄且先端尖（圖5A）, 有的個(gè)體外套竇寬且先端鈍圓[2]（圖5B）。

圖5 贛榆餅干鏡蛤兩種不同單倍型個(gè)體的外套竇形態(tài)比較Fig. 5 Two different kinds of pallial sinus ofDosinia biscoctafrom Ganyu

莊啟謙對(duì)薄片鏡蛤進(jìn)行了詳盡的描述, 把薄片鏡蛤分為Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）和Dosinia corrugate（Hanleyaba型）幾種不同的類型[2]。本研究發(fā)現(xiàn)薄片鏡蛤的不同個(gè)體存在形態(tài)和基因序列的差異, 所測(cè)得的樣品中28S rRNA出現(xiàn)兩個(gè)單倍型, COI基因序列中出現(xiàn)3個(gè)單倍型。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 28S rRNA基因序列中的兩個(gè)單倍型個(gè)體的殼寬存在差異, 小個(gè)體D. corrugate（DDA）（圖 6 A）的殼寬反而大于大個(gè)體D. corrugata（DDB）（圖6 B）的殼寬。而且兩個(gè)體的小月面形狀也存在差異（圖6）,D. corrugata（DDB）的殼形在腹部中央偏后的部位略呈尖形[2], 符合對(duì)Dosinia corrugate（Penicillata型）的描述[2]。D. corrugata（DDA）（圖6 A）的外套竇略寬, 彎入特別深, 斜伸至貝殼近前方,先端略尖, 和記載中對(duì)Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）、Dosinia corrugate（Hanleyaba型）[2]的描述都有所不同。因此對(duì)于遼寧丹東海區(qū)的D. corrugata（DD）有待作進(jìn)一步的研究。

圖6 丹東薄片鏡蛤的兩個(gè)不同單倍型殼型和小月面形狀比較Fig. 6 Two different haploid genotype ofDosinella corrugatafrom Dandong

3.3 兩種不同聚類方法所得分子系統(tǒng)樹的差異分析

鑒于本研究所涉及的鏡蛤種類之間的堿基差異較小, 因此選擇最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony methods, 簡(jiǎn)稱 MP）和鄰位相連法（Neighbor-joining,簡(jiǎn)稱NJ）進(jìn)行分析。最大簡(jiǎn)約法（MP）所得的進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钍怯尚蛄猩系拿總€(gè)堿基、氨基酸的狀態(tài)決定的（一個(gè)序列上包含多個(gè)酶切位點(diǎn), 而每個(gè)酶切位點(diǎn)的存在與否是由幾個(gè)堿基的狀態(tài)決定的, 也就是說一個(gè)序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點(diǎn)狀態(tài),當(dāng)多個(gè)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析時(shí), 進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钜簿陀蛇@些堿基的狀態(tài)決定了）。鄰位相連法（NJ）所得進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的形成不同于 MP樹, 不是由序列堿基、氨基酸狀態(tài)決定的, 而是取決于兩兩序列的進(jìn)化距離, 因此本研究中NJ樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與MP樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在較小差異。所得的兩種不同分子系統(tǒng)樹都進(jìn)行了 Bootstrap檢驗(yàn)。總體上, 兩種聚類方法所得分子系統(tǒng)樹的結(jié)果是一致的, 較真實(shí)地評(píng)估了中國(guó)北方沿海潮間帶常見鏡蛤（日本鏡蛤Dosinia japonica、薄片鏡蛤Dosinia corrugata、餅干鏡蛤Dosinia biscocta）的進(jìn)化關(guān)系。

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Received: May, 23, 2010

Key words:Dosinia; classification; COI; 28S rRNA

Abstract:To clarify the taxonomic status of commonDosiniafrom northern China, we collected and analyzed samples from four locations （Dandong, Yantai, Weihai, and Lianyungang） along north China’s coast using both morphological characters and DNA sequencing （nuclear 28S rRNA and mitochondrial COI sequence） data. The result suggests thatDosinia japonica, Dosinia corrugataandDosinia biscoctaare common species in intertidal areas of northern China, andD. biscoctaandD. japonicaare clustered closely. Morphology differences exist among individuals ofD. biscoctaof Lianyungang, as well asD. corrugataof Dandong. All of these samples need to be further investigated.

（本文編輯:梁德海）

Species of common Dosinia from intertidal zones of northern China

LIU Ze-hao1, LI Jie1, YANG Xue-ling3, WANG Hai-yan2, LI Yong-qiang1, ZHANG Su-ping2, XU Feng-shan2

（1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China ; 3.Bureau of Animal Husbandry and Fisheries, Fianjin 301800, China）

Q959.1

A

1000-3096（2010）12-0030-06

2010-05-23;

2010-07-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（40876084）; 海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200805069）; 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所知識(shí)創(chuàng)新前沿項(xiàng)目（2007-12）。

劉澤浩（1985-）, 男, 河北衡水人, 碩士, 研究方向: 海洋貝類分子系統(tǒng)分類, E-mail: adam004@163.com; 王海艷, 通信作者, 副研究員,研究方向: 海洋貝類分類及系統(tǒng)演化, E-mail: haiyanwang@ qdio.ac.cn