張亞輝，劉征濤，王一喆，閆振廣，王 宏，楊霓云

中國環(huán)境科學(xué)研究院，國家環(huán)境保護(hù)化學(xué)品生態(tài)效應(yīng)與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

Cu2+和Cd2+對斑馬魚胚胎早期發(fā)育的聯(lián)合毒性

張亞輝，劉征濤*，王一喆，閆振廣，王 宏，楊霓云

中國環(huán)境科學(xué)研究院，國家環(huán)境保護(hù)化學(xué)品生態(tài)效應(yīng)與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

采用斑馬魚胚胎早期發(fā)育技術(shù)，測定Cu2+和Cd2+2種重金屬對胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng).以24 h致死和72 h胚胎孵化抑制為毒性終點(diǎn)，2種重金屬的劑量-效應(yīng)曲線可用Weibull函數(shù)或Logit函數(shù)有效描述，由最佳擬合函數(shù)計(jì)算得出半數(shù)致死濃度(LC50)或半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為毒性效應(yīng)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)毒性終點(diǎn)的重金屬毒性大小順序均為Cu2+＞Cd2+.應(yīng)用濃度加和(CA)與獨(dú)立作用(IA)2種模型，對72 h孵化抑制率的無觀測效應(yīng)濃度(NOEC)配比混合物的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行了預(yù)測，通過混合物試驗(yàn)觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間與CA模型和IA模型預(yù)測的劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行比較分析表明，2種模型都可以有效預(yù)測斑馬魚胚胎孵化的聯(lián)合毒性.

重金屬;聯(lián)合毒性;斑馬魚胚胎;濃度加和;獨(dú)立作用

Abstract:The toxicities of two heavy metals Cu2+and Cd2+to embryo development were determined using the zebrafish embryo early development toxicity technique.The dose-response curves of the two heavy metals could be effectively characterized by the Logit and Weibull functions on the two toxicity endpoints of 24 h lethal rate and 72 h hatch inhibition rate.The median lethal concentration (LC50)and the median effect concentration(EC50)calculated by the best-fitted functions were used as the toxicity evaluation criteria. The toxicity order of the two heavy metals on the two observed toxicity endpoints according to the value of either LC50or EC50both showed that Cu2+＞Cd2+.The joint toxicity was predicted using themixture ratio of the non-observed effect concentration(NOEC)of 72 h hatch inhibition rate by two models of concentration addition(CA)and independent action(IA)，then compared with the 95% confidence intervals of the mixture experimental data.The results indicated that the two models could both predict joint toxicity of zebrafish embryo hatching effectively.

Keywords:heavy metal;joint toxicity;zebrafish embryo;concentration addition;independent action

重金屬污染已成為我國水環(huán)境污染日益突出的問題之一，在諸多河流［1-2］及河口海岸［3-4］環(huán)境水體中都可檢測到多種重金屬超出相應(yīng)的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限值.由于水生生物一般都暴露于多種重金屬組成的混合物中，即使單一重金屬低于相應(yīng)的水質(zhì)基準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)限值，多種重金屬共存也可能對水生生物產(chǎn)生顯著的聯(lián)合毒性作用［5］.SPEHAR 等［6］報(bào)道了As5+，Cd2+，Cr5+，Cu2+，Hg2+和 Pb2+6種重金屬在美國水質(zhì)基準(zhǔn)水平(1986年)下對虹鱒魚和呆頭魚以及大型蚤的聯(lián)合毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，在基準(zhǔn)最大濃度(CMC)下重金屬混合物對虹鱒魚和大型蚤造成幾乎100%的致死毒性，基準(zhǔn)連續(xù)濃度(CCC)的混合暴露則顯著抑制了大型蚤的繁殖和呆頭魚的生長.ENSERINK等［7］報(bào)道了As5+，Cd2+，Cr5+，Cu2+，Hg2+，Pb2+，Ni2+和 Zn2+8種重金屬在荷蘭水質(zhì)基準(zhǔn)安全限值下造成96%大型蚤和50%鮭魚幼體死亡的聯(lián)合毒性，該試驗(yàn)結(jié)果促使荷蘭重新修訂水質(zhì)基準(zhǔn).OTITOLOJU等［8］采集 Lagos湖的底棲生物，調(diào)查了 Cu2+，Zn2+，Pb2+，Cd2+和 Hg2+5種重金屬的聯(lián)合毒性作用，建議制訂重金屬的環(huán)境實(shí)際安全限值或水質(zhì)基準(zhǔn)考慮聯(lián)合毒性作用特別是重金屬混合物的協(xié)同作用.COOPER等［9］報(bào)道了Cu2+，Pb2+和Zn2+在美國水質(zhì)基準(zhǔn)CCC和加拿大水質(zhì)基準(zhǔn)下，對 2 種 蚤 類 (Ceriodaphniadubia和Daphnia carinata)產(chǎn)生了顯著的急性聯(lián)合毒性和慢性聯(lián)合毒性.因此，為有效地評價(jià)環(huán)境水體中重金屬的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，制訂對水生生物更加“安全”的環(huán)境閾值，需要考慮重金屬混合物的聯(lián)合毒性作用.

魚類胚胎用于環(huán)境污染物的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，對大多數(shù)污染物來說比成魚急性毒性試驗(yàn)靈敏度更高［10］.為保護(hù)魚類的整個(gè)生命周期，對重金屬的魚類早期發(fā)育的聯(lián)合毒性進(jìn)行研究，將有利于制訂更嚴(yán)格的水質(zhì)基準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)來保護(hù)水生態(tài)系統(tǒng).斑馬魚胚胎在整個(gè)早期發(fā)育階段受精卵透明性很好，可對約20種效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行觀察分析［11］，與成魚致死率這個(gè)單一指示終點(diǎn)相比，更有利于揭示污染物的毒性作用機(jī)制.因此，斑馬魚胚胎試驗(yàn)廣泛用于各種污染物［12-15］的毒性調(diào)查中.迄今為止，關(guān)于重金屬對斑馬魚胚胎試驗(yàn)單一毒性的研究已有諸多報(bào)道［16-18］，但僅有少數(shù)研究對重金屬的斑馬魚胚胎聯(lián)合毒性進(jìn)行了探討［19］.重金屬對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性研究多集中在較高濃度(如EC50或LC50)下的聯(lián)合毒性作用，關(guān)于重金屬在低濃度〔如無觀測效應(yīng)濃度(NOEC)〕下的聯(lián)合毒性鮮見報(bào)道.

通過研究重金屬Cu2+和 Cd2+對斑馬魚胚胎在不同發(fā)育時(shí)期的毒性效應(yīng)，獲得敏感的毒性觀察終點(diǎn)——72 h胚胎孵化抑制率，研究了該敏感毒性終點(diǎn)下無觀測效應(yīng)濃度(NOEC)配比重金屬混合物對斑馬魚孵化的聯(lián)合毒性作用.筆者以混合物試驗(yàn)觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間與濃度加和(Concentration Addition，CA)及獨(dú)立作用(Independent Action，IA)2個(gè)模型預(yù)測的劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行比較分析，獲得基于試驗(yàn)觀測數(shù)據(jù)置信區(qū)間的低濃度下重金屬混合物對斑馬魚胚胎早期發(fā)育的聯(lián)合毒性作用，為環(huán)境水體中Cu2+和Cd2+的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)與水質(zhì)基準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù).

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑

CuSO4·5H2O，CdCl2·2.5H2O，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KCl和NaHCO3等試劑均為分析純，用去離子水配制成儲備液備用.按照 ISO 7346-3標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的比例加入一定體積的無機(jī)鹽儲備液，用充分曝氣的去離子水稀釋成試驗(yàn)溶液，充分震蕩后，放入(26±1)℃培養(yǎng)箱中過夜備用.

1.2 試驗(yàn)方法

采用實(shí)驗(yàn)室長期穩(wěn)定培養(yǎng)的斑馬魚，魚齡為4～12 m，雌雄比為1∶2，水溫為(26±1)℃，光照黑暗比為14 h∶10 h.飼養(yǎng)用水為經(jīng)過充分曝氣的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水(ISO 7346-3)，pH為 7.5±0.2，硬度(以CaCO3計(jì))為175 mg/L左右.每日喂食2次新鮮孵化的活鹵蟲，1次蝦片.晚上關(guān)燈后或早上開燈前放入玻璃制魚卵收集器，魚卵收集器用2 mm綠色塑料網(wǎng)覆蓋在玻璃盒之上，插上綠色塑料仿真水草吸引魚在收集器上產(chǎn)卵，開燈30 min后開始收集魚卵，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水快速沖洗2～3次，去除殘留物后，用立體顯微鏡挑出分裂正常的受精卵，在1 h內(nèi)暴露于染毒溶液中開始試驗(yàn).

選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)重金屬或混合物設(shè)置10～12個(gè)濃度，各濃度設(shè)置3個(gè)平行.每個(gè)培養(yǎng)板的第1列4個(gè)孔加入2 m L標(biāo)準(zhǔn)稀釋水作為空白對照，其余20個(gè)孔加入2 m L重金屬溶液或其混合物的同一濃度的染毒溶液，然后放入1枚正常發(fā)育的受精卵，用膠帶密封蓋子和培養(yǎng)板以避免溶液蒸發(fā)，置于(26±1)℃的培養(yǎng)箱中.

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

參照文獻(xiàn)［16，20］記錄的染毒過程中胚胎發(fā)育的Cu2+和Cd2+具有代表性的毒性終點(diǎn)，選擇24 h致死率和72 h孵化抑制率對劑量 -效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，采用Logit函數(shù)和 Weibull函數(shù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合，選擇擬合相關(guān)系數(shù)(R)越高或均方根誤差(RMSE)越低的函數(shù)為最佳擬合函數(shù);同時(shí)采用文獻(xiàn)［21］中的方法，應(yīng)用Matlab程序計(jì)算單一污染物及混合物的試驗(yàn)觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間，所得數(shù)據(jù)用 Origin 7.5繪圖.無觀測效應(yīng)濃度(NOEC)由Dunnett檢驗(yàn)［22］確定.

1.4 斑馬魚早期發(fā)育聯(lián)合毒性的預(yù)測模型

采用混合物聯(lián)合毒性分析中廣泛應(yīng)用的2個(gè)模型——濃度加和(CA)模型與獨(dú)立作用(IA)模型，針對Cu2+和Cd2+混合物對斑馬魚胚胎孵化的聯(lián)合毒性進(jìn)行預(yù)測.其中CA模型用于預(yù)測具有相同或相似作用機(jī)制的化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合毒性作用［23-24］，計(jì)算公式:

式中，ECxi為混合物中i組分單獨(dú)產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)的濃度;ECxmix為產(chǎn)生效應(yīng)x%的混合物濃度;pi為i組分的濃度占混合物濃度的百分比;n為混合物組分?jǐn)?shù).

IA模型一般用來預(yù)測相異毒性作用機(jī)制的化學(xué)物質(zhì)組成的混合物毒性［25］，計(jì)算公式:

式中，E(cmix)為混合物總濃度(cmix)產(chǎn)生的總效應(yīng);E(ci)為混合物中i組分濃度(ci)單獨(dú)產(chǎn)生的效應(yīng).

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+和Cd2+對斑馬魚胚胎發(fā)育的劑量-效應(yīng)關(guān)系分析

重金屬Cu2+和Cd2+對斑馬魚胚胎發(fā)育的2個(gè)毒性終點(diǎn)24 h致死率和72 h孵化抑制的劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)、擬合曲線及觀測數(shù)據(jù)的95%置信上限和下限曲線分別繪于圖1(Cu2+)和圖2(Cd2+).從圖1，2可以看出，2種重金屬的24 h致死率和72 h孵化抑制率與毒物濃度間呈“S”狀.觀測的劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)分別用Logit函數(shù)和Weibull函數(shù)進(jìn)行非線性擬合，擬合函數(shù)及其參數(shù)和相關(guān)統(tǒng)計(jì)量〔相關(guān)系數(shù)(R)和均方根誤差(RMSE)〕列于表1.從表1看出，非線性擬合的R值均大于0.96，RMSE均小于0.1，2個(gè)函數(shù)都可以很好地描述 Cu2+和 Cd2+對斑馬魚胚胎的24 h致死率和72 h孵化抑制率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系.根據(jù)最佳非線性函數(shù)的選擇原則，以及 Cu2+和 Cd2+對斑馬魚胚胎 24 h致死率與Cd2+的72 h胚胎孵化抑制率的劑量-效應(yīng)關(guān)系，選擇Weibull函數(shù)為最佳擬合函數(shù)，Cu2+的72 h胚胎孵化抑制率選擇Logit為最佳函數(shù).另外，用Matlab程序計(jì)算得到觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間的上限和下限［21］，可有效表征試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)的變化范圍.

圖1 Cu2+對胚胎24 h致死率和72 h孵化抑制率的劑量－效應(yīng)關(guān)系Fig.1 The dose-response relationship of Cu2+of 24 h lethal rate(a)and 72 h hatch inhibition rate(b)

利用表1中最佳擬合函數(shù)的 2個(gè)參數(shù) α和 β值，可以計(jì)算出Cu2+和Cd2+對24 h胚胎致死和72 h孵化抑制的致死濃度或效應(yīng)濃度，24 h半數(shù)致死濃度(LC50)和72 h半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)及95%的置信區(qū)間見表1.隨著重金屬濃度的增大，斑馬魚胚胎24 h致死率和72 h孵化抑制率均呈增大趨勢.以24 hLC50或72 hEC50數(shù)值為毒性效應(yīng)的評判標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)毒性終點(diǎn)的毒性大小順序均為 Cu2+＞Cd2+.其中2種重金屬的24 hLC50相差1個(gè)數(shù)量級，從 4.99 μmol/L(Cu2+)到 94.56 μmol/L (Cd2+)，而72 h孵化抑制率的EC50相差3個(gè)數(shù)量級，從 0.41 μmol/L(Cu2+)到 29.28 μmol/L (Cd2+).2種重金屬的72 h孵化抑制率的EC50值都比24 hLC50值小，因此，2種重金屬對斑馬魚胚胎的敏感指標(biāo)為72 h孵化抑制率.2種重金屬在72 h孵化抑制率的無觀測效應(yīng)濃度(NOEC)數(shù)值大小順序與72 h孵化抑制率一致，從0.20μmol/L(Cu2+)到18.00μmol/L(Cd2+)，相差3個(gè)數(shù)量級.

圖2 Cd2+對胚胎24 h致死率和72 h孵化抑制率的劑量－效應(yīng)關(guān)系Fig.2 The dose-response relationship of Cd2+of 24 h lethal rate(a)and 72 h hatch inhibition rate(b)

JOHNSON等［16］用Plumouth城市自來水為參照溶液〔Cu2+的背景值為(10.70±0.98)μg/L〕，研究了 Cu2+對斑馬魚胚胎發(fā)育的形態(tài)和功能的影響.胚胎發(fā)育24 hLC50約為327μg/L，與該文報(bào)道的24 hLC50(317μg/L)基本一致.另外，JOHNSON等［16］報(bào)道了50μg/L Cu2+可對斑馬魚胚胎孵化產(chǎn)生抑制作用，這與表1中的結(jié)果相差較大，可能與 Cu2+染毒溶液中標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中離子濃度有關(guān)，具體原因尚待進(jìn)一步研究.

CHENG等［20］從細(xì)胞和分子水平上研究了Cd2+對斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)和各種致畸效應(yīng)，28 h的LC50為168μmol/L，致死效應(yīng)和致畸效應(yīng)產(chǎn)生的EC50為138μmol/L.其中LC50值為該文中24 hLC50的1.78倍，其原因可能是因?yàn)槲墨I(xiàn)［20］報(bào)道的是28 h胚胎的致死效應(yīng)，比該文中胚胎暴露的時(shí)間長;另外，最重要的是胚胎染毒開始的時(shí)間不同，該文采取受精1 h內(nèi)的胚胎染毒，而文獻(xiàn)［20］在胚胎正常發(fā)育5 h后才開始染毒.此外，胚胎暴露于污染物中的發(fā)育階段不同，胚胎靈敏度也會有所變化. GELLERT等［26］在研究斑馬魚胚胎對不同濃度廢水的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚胚胎發(fā)育早期階段，卵膜對外界污染的通透性會隨著胚胎的生長逐漸降低，特別是前4 h.端正花等［27］考察了0 h和8 h染毒2種不同方式下己烯雌酚對斑馬魚胚胎的亞致死效應(yīng)，其中48 h心率變緩和72 h孵化抑制的EC50值分別從0.24 mg/L(0 h染毒)增至0.46 mg/L(8 h染毒)，從0.14 mg/L(0 h染毒)增至0.33 mg/L(8 h染毒)，表明染毒開始時(shí)間不同對斑馬魚胚胎早期發(fā)育毒性會產(chǎn)生很大影響.

表1 Cu2+和Cd2+對胚胎24 h致死率和72 h孵化抑制率的劑量－效應(yīng)曲線的擬合函數(shù)及相關(guān)統(tǒng)計(jì)量Table 1 The dose-response functions of Cu2+and Cd2+and some statistics of 24 h lethal rate and 72 h hatch inhibition rate

2種重金屬對甌江彩鯉［28］(C.carpiovar.color)和澤蛙蝌蚪［29］的急性毒性研究中，不同時(shí)間毒性順序均表現(xiàn)為Cu2+＞Cd2+，這與該文報(bào)道的毒性順序一致.但對不同受試生物(如對淡水發(fā)光菌青?；【鶴67［30］)的發(fā)光抑制，毒性大小順序?yàn)?Cd2+＞Cu2+.不同受試生物可能由于自身生理機(jī)能不同對重金屬的敏感性存在很大差異.此外，不同生物發(fā)育階段、試驗(yàn)條件以及重金屬離子的形態(tài)等都可能對重金屬的毒性產(chǎn)生較大影響［31］.

斑馬魚胚胎及仔魚暴露于重金屬 Cu2+和 Cd2+溶液中產(chǎn)生的各種畸形如圖3所示.與48 h正常發(fā)育胚胎〔見圖3(a)〕相比，0.6μmol/L Cu2+暴露組胚胎出現(xiàn)了心包囊腫〔見圖3(c)〕和尾部彎曲〔見圖3(e)〕，Cd2+(18μmol/L)染毒組也產(chǎn)生了心包囊腫〔同圖3(e)〕.與72 h正常孵化的仔魚〔見圖3 (b)〕相比，0.2μmol/L Cu2+暴露組胚胎出現(xiàn)了心包囊腫〔見圖3(d)〕，8μmol/L Cd2+出現(xiàn)了心包囊腫和尾部彎曲〔見圖3(f)〕.2種重金屬造成的胚胎畸形與文獻(xiàn)［16］報(bào)道的斑馬魚胚胎和仔魚產(chǎn)生心包囊腫、尾部彎曲等畸形情況相同.

圖3 正常發(fā)育和非正常發(fā)育斑馬魚胚胎和仔魚Fig.3 Normal and abnormal zebrafish embryo and larva fish

2.2 Cu2+和Cd2+混合物的聯(lián)合毒性

選擇Cu2+和 Cd2+敏感的毒性終點(diǎn)——72 h胚胎孵化抑制，考察在該毒性終點(diǎn)下NOEC配比混合物對斑馬魚胚胎孵化抑制的聯(lián)合毒性，運(yùn)用濃度加和(CA)和獨(dú)立作用(IA)2個(gè)模型預(yù)測聯(lián)合毒性，并與混合物試驗(yàn)觀測數(shù)值的95%置信區(qū)間進(jìn)行比較分析，獲得 Cu2+和 Cd2+對斑馬魚胚胎孵化的聯(lián)合毒性.2種重金屬NOEC配比混合物的總劑量-效應(yīng)曲線以及觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間，與CA和IA 2個(gè)模型的預(yù)測曲線見圖4(a).從圖4可以看出，CA和IA 2個(gè)模型預(yù)測的劑量-效應(yīng)曲線都分布在混合物觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間內(nèi)，CA模型預(yù)測的聯(lián)合毒性效應(yīng)要比IA模型預(yù)測結(jié)果高，2個(gè)模型在高濃度和低濃度范圍預(yù)測較為接近.在30% ～65%效應(yīng)水平中，IA預(yù)測曲線與95%置信下限曲線幾乎重合.CA模型預(yù)測的混合物毒性效應(yīng)在測定濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生比較精確的結(jié)果，2種重金屬NOEC配比混合物在72 h胚胎孵化抑制效應(yīng)產(chǎn)生了明顯的加和特征.從混合物觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間來看，2個(gè)模型都可對NOEC配比混合物的聯(lián)合孵化抑制率進(jìn)行預(yù)測.從整體上來看，CA模型對NOEC配比混合物的斑馬魚胚胎72 h孵化抑制效應(yīng)預(yù)測結(jié)果要比 IA模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確，IA模型傾向于低估混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng).

為了預(yù)測Cu2+和Cd2+在各自NOEC下對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性，選擇混合物總濃度cmix等于2種重金屬NOEC總和這一點(diǎn)〔見圖4(a)中箭頭標(biāo)出的點(diǎn)〕，比較分析了單一重金屬污染物的毒性效應(yīng)與觀測的聯(lián)合毒性效應(yīng)以及CA和IA 2個(gè)模型預(yù)測的聯(lián)合毒性效應(yīng).圖4(b)為混合物毒性(Obs)與2種重金屬(Cu2+，Cd2+)以及CA模型預(yù)測效應(yīng)(CA)和IA模型預(yù)測效應(yīng)(IA)的對比.在72 h孵化抑制率的NOEC下，Cu2+(0.20μmol/L)和 Cd2+(18.0 μmol/L)分別產(chǎn)生了13.36%和23.52%的孵化抑制效應(yīng)，2種重金屬在該濃度下的混合物濃度為18.20μmol/L，對斑馬魚胚胎孵化產(chǎn)生了38.75%的聯(lián)合抑制毒性.CA模型和IA模型在該濃度下的預(yù)測效應(yīng)分別為56.50%和33.74%，與混合物試驗(yàn)觀測毒性(Obs)相對偏差分別為45.82%(絕對值)和12.94%.CA模型對混合物的聯(lián)合孵化抑制率的預(yù)測結(jié)果偏高，觀測的混合物效應(yīng)與IA預(yù)測結(jié)果較為接近.但是，從圖4(a)可以看出，混合物的4次平行試驗(yàn)的觀測數(shù)據(jù)均分布在劑量-效應(yīng)曲線的95%置信區(qū)間內(nèi)，因此，CA和IA 2個(gè)模型都可對混合物產(chǎn)生的孵化聯(lián)合抑制毒性進(jìn)行預(yù)測.

6種有機(jī)磷殺蟲劑對青?；【鶴67的聯(lián)合毒性研究發(fā)現(xiàn)，CA模型和IA模型對混合物的毒性效應(yīng)預(yù)測結(jié)果相近，2個(gè)模型都能夠?qū)τ袡C(jī)磷殺蟲劑的聯(lián)合發(fā)光毒性進(jìn)行有效預(yù)測［24］;JUNGHANS等［32］研究了 8種磺酰脲除草劑對綠藻(Scenedesmus vacuolatus)的聯(lián)合毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA對除草劑混合物毒性產(chǎn)生比較精確的預(yù)測，但 CA模型預(yù)測的劑量-效應(yīng)曲線與IA模型的預(yù)測結(jié)果相差較小.在對2種重金屬混合物的聯(lián)合孵化抑制毒性研究中，2個(gè)模型預(yù)測的劑量-效應(yīng)曲線存在一定的差別，但都分布在混合物試驗(yàn)觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間內(nèi)，因此也認(rèn)為，CA模型和 IA模型都能對重金屬 Cu2+和Cd2+的斑馬魚胚胎孵化的聯(lián)合毒性進(jìn)行預(yù)測.

圖4 72 h孵化抑制率NOEC配比混合物對斑馬魚胚胎孵化抑制的劑量－效應(yīng)曲線與混合物的聯(lián)合毒性(Obs)與單一重金屬毒性，CA模型預(yù)測毒性和IA模型預(yù)測毒性比較Fig.4 The dose-response relationship of the m ixture in the ratio of NOEC on 72 h hatch inhibition rate(a)and comparison of the joint toxicity(Obs)and single toxicity of the heavy metals with CA prediction(CA)and IA prediction(IA)(b)

3 結(jié)論

a.重金屬Cu2+和Cd2+對斑馬魚胚胎具有明顯的毒性作用，以LC50或EC50為毒性效應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，所觀察的24 h致死和72 h孵化抑制2個(gè)毒性終點(diǎn)，毒性大小順序均為 Cu2+＞Cd2+，其中72 h孵化抑制表現(xiàn)為較敏感的毒性終點(diǎn).

b.應(yīng)用濃度加和(CA)與獨(dú)立作用(IA)2個(gè)模型對72 h孵化抑制NOEC配比的重金屬混合物進(jìn)行的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CA模型預(yù)測的聯(lián)合效應(yīng)大于 IA模型，在觀測數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間范圍內(nèi)，2個(gè)模型都可有效預(yù)測 2種重金屬混合物的聯(lián)合孵化抑制毒性.

致謝:斑馬魚的養(yǎng)殖和胚胎毒性試驗(yàn)得到南開大學(xué)朱琳教授和端正花老師的大力幫助和指導(dǎo)，在此表示衷心的感謝.

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Joint Toxicity o f Cu2+and Cd2+to Early Deve lopm ent o f Zebra fish Em bryos

ZHANG Ya-hui，LIU Zheng-tao，WANG Yi-zhe，YAN Zhen-guang，WANG Hong，YANG Ni-yun
Key Laboratory of Ecological Effect and Risk Assessment of Chemicals，M inistry of Environmental Protection，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China

X131.2

A

1001-6929(2010)11-1415-06

2010-05-25

2010-08-20

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2008ZX0526-003)

張亞輝(1979-)，女，河南寶豐人，助理研究員，博士，zhangyahui@craes.org.cn.

*責(zé)任作者，劉征濤(1965-)，男，江蘇江陰人，研究員，博士，主要從事環(huán)境污染生態(tài)學(xué)及毒理學(xué)研究，liuzt@craes.org.cn