郭 楊，韓 蕊，杜文婷，吳嘉怡，劉 旺，蔡信德*

1.中國環(huán)境科學研究院，北京 100012

2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所，廣東 廣州 510655

鄰苯二甲酸酯復合污染對土壤微生態(tài)的影響

郭 楊1，2，韓 蕊2，杜文婷2，吳嘉怡2，劉 旺2，蔡信德2*

1.中國環(huán)境科學研究院，北京 100012

2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所，廣東 廣州 510655

在實驗室模擬條件下，通過測定土壤呼吸，w(PAEs)和微生物RAPD條帶數(shù)，研究了鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)3種PAEs復合污染對農田土壤基礎呼吸、微生物多樣性的影響.結果表明，PAEs污染初期的土壤基礎呼吸被激活，但這種激活作用隨著培養(yǎng)時間的延長而減弱，400 mg/kg組土壤基礎呼吸最高;3種PAEs含量均有一定程度的下降，其中w(DEP)顯著降低;試驗終止時各組多樣性條帶的比例較預培養(yǎng)后有所增加(平均增加13%);不同處理組土壤微生物群落DNA序列Shannon-Weaver指數(shù)順序為0 mg/kg＞50 mg/kg＞100 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg.可見，PAEs復合污染提高了土壤基礎呼吸，但降低了土壤微生物多樣性.

鄰苯二甲酸酯;土壤;微生物多樣性;RAPD;土壤呼吸

Abstract:The impacts of combined phthalate acid ester(PAE)contamination，including dimethyl phthalate(DMP)，diethyl phthalate (DEP)，and di-n-octyl phthalate(DOP)，on farm land soil basal respiration and microbial diversity were studied by monitoring soil respiration，soil PAEs concentration and random amp lified polymorphic DNA(RAPD)marker under laboratory simulation testing.The results showed that the soil basal respiration was activated by PAEs at an early stage，reaching a maximum value at 400 mg/kg PAEs treatment.However，this type of activation effect decreased with prolonged PAE exposure time.In addition，the concentration of PAEs in the soils decreased，especially the DEP concentration.The number of specific RAPD bands increased in all PAE treatments at the end of incubation，reaching 13% higher than that of the early stage of incubation.The Shannon-Weaver index of soil microbial community DNA sequence in all treatments was:0 mg/kg＞50 mg/kg＞100 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg.Overall，the results indicated that the combined PAE contamination in soilmay stimulate soil basal respiration，but decrease soilmicrobial diversity.

Keywords:phthalate ester;soil;microbial diversity;RAPD;soil respiration

鄰苯二甲酸酯(Phthalic Acid Easters，PAEs)是環(huán)境中一種常見的有機污染物［1-5］，具有內分泌干擾毒性和生物累積性［6-9］，已被我國列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物［10］.PAEs污染不但影響農田土壤質量［11-12］，而且將影響土壤微生物的數(shù)量和多樣性，進而影響生態(tài)系統(tǒng)功能［13-14］.

針對土壤鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二(乙基-己基)酯(DEHP)單一污染對微生物影響的報道［1，15-18］較多;謝慧君等［14］報道了 PAEs復合污染對土壤微生物代謝和遺傳多樣性的影響，但PAEs復合污染對土壤基礎呼吸以及對土壤微生物多樣性方面的報道還較少.筆者結合土壤呼吸，w(PAEs)和土壤微生物RAPD條帶數(shù)變化，對國控3種PAEs(包括DMP，DEP和DOP)污染對農田土壤微生物活性和多樣性的影響進行了研究，以期為PAEs污染土壤的健康風險評估提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用土壤取自華南農業(yè)大學農場水稻田耕作層，經風干、碾碎后過 5 mm篩.土壤指標:w(有機質)為2.32%，w(TN)為0.10%，w(TP)為0.073%，w(TK)為2.00%，pH為5.56，質地為中壤土.

DMP，DEP和DOP(分析純)均購自天津市大茂化學試劑廠，取3種 PAEs溶于丙酮，制成5 g/L儲備液，冰箱4℃保存.3種PAEs標樣購自環(huán)境保護部標準樣品研究所，規(guī)格2 m L 1 000μg/m L.SBSA引物購自北京賽百盛基因技術有限公司，RAPDPCR所需其他試劑均購自上海生工生物工程有限公司.PAEs提取和分析過程中所接觸的所有玻璃器皿都必須先用洗液洗滌，置300℃烘箱過夜，冷卻后用色譜純丙酮和正己烷淋洗，使用前風干.

1.2 土壤染毒方法

取少量過0.30 mm篩的土壤加入5 g/L PAEs儲備液，使3種PAEs質量分數(shù)均達到1 000 mg/kg.待丙酮揮發(fā)，取適量上述土壤與未污染土壤混合制成5個濃度的污染土壤，3種PAEs質量分數(shù)均為0，50，100，200和400 mg/kg(分別為1～5組)，每個樣品1 000 g，每個濃度作3個平行，裝入清潔陶瓷盆中.每盆加入適量蒸餾水，使含水量保持在30%，培養(yǎng)箱25℃暗培7 d進行預培養(yǎng)，微生物群落充分恢復后開始試驗.試驗共持續(xù) 30 d，培養(yǎng)箱25℃暗培.

1.3 土壤呼吸測定

自1.2節(jié)中的土壤每盆各取150 g，裝入2250實驗室土壤呼吸系統(tǒng)(英國ADC公司)測定土壤呼吸2 h.將土壤放回各自盆中混勻，每5 d測定一次土壤呼吸和土壤含水率，共計30 d.第一次和最后一次測定土壤呼吸時，每盆用紙袋各保留30 g鮮土，-20℃冰箱保存，用于RAPD-PCR分析;用潔凈玻璃培養(yǎng)皿各保留 20 g鮮土，風干后用于w(PAEs)測定.

1.4 w(PAEs)測定

將1.3節(jié)中風干土樣過0.30 mm篩，準確稱取2 g裝入50 m L帶塞錐形瓶，加入10 mL正己烷/丙酮(體積比為1/1)振搖數(shù)下，超聲萃取20 min，靜置沉淀后傾出上層溶劑，重復3次，合并溶劑相，旋蒸至1 m L.溶劑相凈化過程參照文獻［19］，洗脫液旋蒸至體積小于0.2 m L，加入3 mL正己烷溶劑置換，旋蒸至1 m L，GC分析.

使用島津 GC-17A氣相色譜儀(日本島津公司).毛細管色譜柱，DB-5(30 m×0.32 mm);載氣，高純氮(N2≥99.999%);進樣口溫度280℃，檢測器(ECD)溫度300℃，不分流進樣，進樣量1μL，升溫程序參考文獻［20］(起始溫度為70℃，保持1 m in，20℃/m in升至130℃，5℃/m in升至230℃，15℃/m in升溫至300℃，保持5 min).

1.5 土壤微生物多樣性分析

土壤微生物多樣性分析采用RAPD方法，土壤總DNA提取參照文獻［21］，使用柱式腐殖酸清除劑(上海生工生物工程有限公司)純化粗DNA作為PCR模板.從一套RAPD引物(SBSA)20條(見表1)中篩選出 A01，A05，A07，A14和 A18五條用于PCR擴增.

表1 SBSA引物序列Table 1 Sequence of RAPD primer(SBSA)

PCR反應體系:10×緩沖液5μL，MgCl2(25 mmol/L)5μL，dNTP(10 mmol/L)1μL，模板DNA 0.5μL(10～100 ng)，引物(5.1μmol/L)3μL，Taq酶(5 U/μL)0.5μL，補雙蒸水(ddH2O)至50μL. PCR反應條件參照文獻［21］(94℃預變性4 min，40個循環(huán)為:94℃變性90 s，36℃退火90 s，72℃延伸2 m in，最后72℃延伸5 min).

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

微生物多樣性采用Shannon-Weaver指數(shù)表示:

式中，Dsh為 Shannon-Weaver指數(shù);Ni為第 i個RAPD條帶的擴增量;N為土壤微生物 DNA的RAPD條帶的擴增總量.Dsh可以反映種群內及種群間的遺傳多樣性分布和差異.

2 結果與討論

2.1 土壤w(PAEs)變化

3種w(PAEs)在30 d的培養(yǎng)中均有所降低(見圖1).試驗終止時 50，100，200和 400 mg/kg組w(DMP)較預培養(yǎng)后分別下降了70.38%，34.83%，65.72%和62.64%;w(DEP)分別下降了73.45%，62.81%，97.95%和29.78%;w(DOP)分別下降了56.20%，55.17%，72.01% 和 43.98%. 其 中w(DEP)下降最為明顯.CARTWRIGHT等［15］認為，DEP生物降解很快，當游離態(tài)和土壤顆粒表面吸附的DEP被分解后，DEP的微生物可利用性降低.該試驗中w(DEP)的變化也證實了這點.

圖1 土壤中w(PAEs)變化Fig.1 Transformation of the PAEs content in treated soils

2.2 PAEs污染對土壤呼吸的影響

PAEs污染對土壤基礎呼吸的影響見圖2.各組土壤基礎呼吸值在前5 d下降較快，之后下降速度變緩.對照組(0 mg/kg)呼吸值始終低于其他組; 400 mg/kg組的土壤呼吸值最高，其前5 d的降幅也最大;100 mg/kg組的土壤呼吸值高于 50和 200 mg/kg組.土壤基礎呼吸值由高至低順序為 400 mg/kg＞100 mg/kg＞50 mg/kg＞200 mg/kg.試驗結果基本與文獻［16］報道的添加PAEs初期土壤基礎呼吸被激活且激活作用隨培養(yǎng)時間的延長而減弱的現(xiàn)象相同.原因可能是 PAEs可作為土壤微生物代謝底物，微生物利用這些底物時表現(xiàn)出較高的代謝活性，土壤基礎呼吸值升高;但隨著培養(yǎng)時間的延長其生物有效性降低，土壤呼吸下降.而對照組土壤呼吸值始終低于 PAEs污染組的原因，可能是微生物可利用碳源總量有限，土壤呼吸保持較低水平且隨著碳源的減少土壤呼吸下降.

但試驗并未出現(xiàn)文獻［16］中的抑制效應，原因可能是與PAEs的性質(屬于非急性毒性污染物)和PAEs在土壤中的存在狀態(tài)相關.DMP，DEP和DOP (其分子量分別為194.19，222.24和390.30，lg KOW分別為1.61，2.38和8.06［22］)復合體系中，DMP和DEP易于被微生物所利用，故未出現(xiàn)土壤呼吸低于對照組的抑制現(xiàn)象;而DBP和DEHP(其分子量分別為278.34和390.30，lg KOW分別為3.74和7.50)生物有效性低于 DMP和 DEP.尹睿等［17］認為，當土壤中DEHP(與DOP結構相似)含量較低時，有較大比例的DEHP與土壤有機物形成復合物，生物可利用的部分減少.因此，當可利用的碳源較少時，微生物降低生理活動抵御污染物的毒害，土壤基礎呼吸被抑制.

圖2 PAEs污染土壤基礎呼吸的變化Fig.2 The results of soil basal respiration

2.3 PAEs對土壤微生物多樣性的影響

5條RAPD引物共擴增出條帶395條.預培養(yǎng)后共擴增出條帶172條，均為多態(tài)性條帶;試驗終止時共擴增出條帶223條，其中非多態(tài)性條帶8條(占3.6%)，多態(tài)性條帶215條(占96.4%).非多態(tài)性條帶是指同一時期的5種處理的土壤微生物 DNA均擴增出的條帶，多態(tài)性條帶是指同一時期的5種處理的土壤微生物DNA并非全擴增出的條帶.

2.3.1 PAEs對土壤DNA序列多樣性的影響

預培養(yǎng)后各引物擴增條帶數(shù)量見表2.從表2可以看出，SBSA05和 SBSA18擴增條帶量最多，并且5個組條帶量順序為0 mg/kg＞50 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg＞100 mg/kg.RAPD引物對各組微生物DNA無特異性選擇，且各組使用相同的土壤制備，故條帶數(shù)量可間接反映各組微生物DNA組成差異，擴增條帶數(shù)越多 DNA序列種類相對就越豐富.

試驗終止時各引物擴增條帶數(shù)量見表3.從表3可以看出，SBSA05擴增條帶量最多，5個組條帶量順序為 0 mg/kg＞50 mg/kg＞100 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg組.由表4可知，試驗結束時5個處理的多態(tài)性條帶(同一樣品試驗前后擴增出的有差異的條帶)所占比例均有所增加(其平均值由20%變化到33%)，說明土壤經不同w(PAEs)處理后，微生物組成發(fā)生變化.該試驗結果與謝慧君等［14］的報道基本相同，PAEs脅迫使某些耐受微生物數(shù)量增多、非耐受微生物減少，土壤微生物多樣性發(fā)生變化.

表2 RAPD引物對預培養(yǎng)后土壤微生物DNA的擴增結果Table 2 The results of amplification ofmicrobial DNA in early stage with RAPD method

表3 RAPD引物對試驗終止時土壤微生物DNA的擴增結果Table 3 The results of amplification ofm icrobial DNA in 30th day with RAPD method

表4 RAPD引物對不同處理土壤中微生物DNA總的擴增結果Table 4 The total results of amplification ofmicrobial DNA in different soils with RAPD method

圖3 土壤微生物多樣性指數(shù)Fig.3 The results of Shannon-Weaver index of microbial diversity in treated soils

2.3.2 土壤微生物群落 DNA序列 Shannon-Weaver指數(shù)

DNA擴增條帶數(shù)簡明表達了土壤微生物DNA序列多樣性的一個側面，但它未能反映群落DNA序列相對多度的信息［23］.Shannon-Weaver指數(shù)能較好地反映群落物種數(shù)量和豐富度.5種處理微生物群落DNA序列Shannon-Weaver指數(shù)存在差異(見圖3).預培養(yǎng)后Shannon-Weaver指數(shù)大小順序為0 mg/kg＞50 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg＞100 mg/kg;試驗終止Shannon-Weaver指數(shù)大小順序為0 mg/kg＞50 mg/kg＞100 mg/kg＞200 mg/kg＞400 mg/kg.對照組培養(yǎng)前后的Dsh值無明顯差異(分別為0.74和0.73);50和100 mg/kg組的Dsh值均上升(分別從0.70和0.51升至0.73和0.61)，說明土壤微生物DNA序列多樣性增加;200和400 mg/kg組的Dsh值降低(分別從0.63和0.58降至0.59和0.51).4個染毒組的 Dsh值始終低于對照組，說明PAEs可降低土壤微生物多樣性，影響土壤健康.至試驗結束，50 mg/kg組的Dsh值達到對照水平，說明土壤低濃度 PAEs污染后，經過一定時間微生物群落可逐漸恢復;100 mg/kg組的Dsh值上升，說明該污染程度下微生物多樣性有恢復趨勢，但能否恢復到對照水平還需進一步長期試驗.相反，至試驗結束200和400 mg/kg組的微生物多樣性降低，且隨著w(PAEs)的增加而降低，說明該污染程度的土壤微生物多樣性(至少在短期內)無法恢復，只有PAEs耐受菌種可生存，土壤微生物多樣性減少，土壤健康受損.

3 結論

a.PAEs復合污染將提高土壤基礎呼吸，但土壤基礎呼吸作用隨著污染程度和污染時間而變化.對照組土壤基礎呼吸始終最低.

b.土壤土著微生物能利用部分的 PAEs，但利用程度因PAEs種類和含量的不同而不同.

c.PAEs污染將導致土壤微生物多樣性降低，對土壤健康造成影響.

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Effects of Com bined Phtha late Acid Ester Contam ination on SoilM icro-Ecology

GUO Yang1，2，HAN Rui2，DU Wen-ting2，WU Jia-yi2，LIU Wang2，CAIXin-de2

1.Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China

2.South China Institute of Environmental Sciences，Ministry of Environmental Protection，Guangzhou 510655，China

X53

A

1001-6929(2010)11-1410-05

2010-06-28

2010-08-16

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2009ZX07211-002);環(huán)境保護部公益項目(200809093)

郭楊(1982-)，男，北京人，guoyang526@126.com.

*責任作者，蔡信德(1965-)，男，廣東梅州人，研究員，博士，主要從事土壤污染修復研究，xindecai@scies.org