程嬋娟，韋 偉，胡尚勤

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400047）

檸檬醛（Citral）是從樟科（Lauraceae）植物山蒼子[Litsea cubeba（Lour）Per]果實(shí)、根及葉所提取精油中一種主要成分，具有廣譜的抗菌性[1-2]。目前就檸檬醛對(duì)白色念珠球菌（Candida albicans）、黃曲霉（Asperillus flavus）的抑菌作用和抑菌機(jī)理方面有較深入的研究[3-5]。并報(bào)道其對(duì)念珠菌、毛癬菌、曲霉菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌和大腸桿菌等真菌和細(xì)菌均有抑制和殺滅的作用[5-7]。

繩狀青霉（Penicillium funiculosum）屬半知菌綱（Deuteromycetes），是植物常見(jiàn)病原菌。該菌可以產(chǎn)生纖維素酶，破壞植物細(xì)胞壁，引起西紅柿莖腐病[8]。在食用菌栽培中也是常見(jiàn)的污染菌。谷物中常見(jiàn)此菌，Lugauskas等報(bào)告表明在谷物收獲、存儲(chǔ)、打粉等整個(gè)加工過(guò)程中均有發(fā)現(xiàn)[9]。P.funiculosum可在木材、皮革制品上生長(zhǎng)，對(duì)軍用篷布、槍套、背包甚至槍彈都有較嚴(yán)重的危害[10-11]。因此，是美國(guó)、中國(guó)軍用標(biāo)準(zhǔn)中霉菌檢驗(yàn)的指示菌之一。如何防治包括P.funiculosum等霉菌對(duì)工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品地侵染以及危害具有重要的意義。然而在防霉研究中，有關(guān)P.funiculosum的研究很少。本文采用目前公認(rèn)對(duì)真菌抑制效果較好的檸檬醛作為材料，以P.funiculosum為對(duì)象，研究采用不同方式以及不同濃度的檸檬醛對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)以及孢子萌發(fā)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

繩狀青霉（Penicillium funiculosum，AS 3.3875），購(gòu)自中科院菌種保藏中心。檸檬醛（分析純），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司

1.2 方法

1.2.1 檸檬醛對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)的抑制作用檢測(cè)

P.funiculosum菌種活化后采用察氏培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)7 d。制備孢子懸浮液、計(jì)數(shù)，同時(shí)檢測(cè)孢子活力[11]。

采用兩種方法研究檸檬醛對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)的抑制作用。

1.2.1.1 濾紙片法[12]

將已滅菌直徑為1.6 cm的濾紙片浸入2、3、4、5和6 mg·mL-15種濃度的檸檬醛溶液中，以50%甘油溶劑為對(duì)照，浸泡2 h后取出晾干。

取0.5 mL孢子懸浮液于裝有4.5 mL察氏上層培養(yǎng)基的試管中，使孢子終濃度為105個(gè)·mL-1。振蕩均勻，倒入準(zhǔn)備好的察氏下層培養(yǎng)基平板上。冷卻后用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片平放于平板上，用封口膠將平板密閉，于25℃培養(yǎng)，24 h后開(kāi)始觀察霉菌生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法量取各試驗(yàn)組抑菌圈直徑。每個(gè)濃度處理設(shè)置3組重復(fù)。并按下列公式計(jì)算抑菌效果：

抑制率（%）＝（試驗(yàn)組抑菌圈直徑－對(duì)照組抑菌圈直徑）/對(duì)照組抑菌圈直徑×100%

1.2.1.2 揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測(cè)法[13]

取P.funiculosum孢子懸液0.5 mL均勻涂布于直徑為9 cm的察氏培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)3 d。用滅菌打孔器打孔得到直徑為5 mm的菌栓。把菌栓（菌絲面向下）放入新鮮的察式平板中央，然后在培養(yǎng)皿蓋（中央）上放置直徑1.6 cm，在不同濃度檸檬醛溶液及50%甘油溶劑對(duì)照中浸泡2 h的濾紙片，用封口膜密封防止檸檬醛揮發(fā)，倒置培養(yǎng)25℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落大小，量取直徑，記錄結(jié)果。

菌落增長(zhǎng)率（%）＝（試驗(yàn)組菌落直徑－0.5）/0.5×100%

抑制率（%）＝（對(duì)照組菌落直徑－試驗(yàn)組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%

MIC[13-14]：找出菌落直徑未增加的平板，去掉封口膜，通風(fēng)24 h除去檸檬醛后，25℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。通風(fēng)后菌落直徑開(kāi)始增加的濃度為最小抑制濃度（MIC）。每個(gè)濃度處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.2 檸檬醛處理不同時(shí)間對(duì)P.funiculosum孢子萌發(fā)的影響

在P.funiculosum孢子懸液中加入適量檸檬醛溶液，使檸檬醛終濃度為3.0 mg·mL-1，密閉，振蕩搖勻，室溫20℃下分別處理10、30、60、90、120 min后于 4℃，5 000 r·min-1離心 10 min，去上清液，再以無(wú)菌水離心洗滌2次，去除檸檬醛。以50%甘油為對(duì)照，每個(gè)時(shí)間處理設(shè)置3組重復(fù)。

處理后的孢子懸液1 mL加入裝有20 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每2 h取樣，采用顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)，并按下列公式計(jì)算其萌發(fā)率與抑制率：

孢子萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)的孢子數(shù)/樣品孢子數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬醛對(duì)P.funiculosum抑制作用

采用濾紙片法以及揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測(cè)法對(duì)不同濃度檸檬醛抑制P.funiculosum作用結(jié)果見(jiàn)表1、2。

從表1中采用濾紙片法檢測(cè)結(jié)果可知，檸檬醛對(duì)P.funiculosum具有明顯的抑制作用。在較高濃度（6.0 mg·mL-1）下抑制作用明顯，抑菌圈直徑為2.33 cm，抑制率達(dá)到45.83%。而在低濃度條件下（3.0～5.0 mg·mL-1），抑菌圈直徑在1.65～1.93之間變化，且據(jù)其所得的抑制率為2.29%～20.42%。在此低濃度范圍內(nèi)，抑菌圈直徑與對(duì)照間無(wú)顯著性差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，將6.0 mg·mL-1作為檸檬醛對(duì)P.funiculosum的最小抑制濃度（MIC）。

揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測(cè)法對(duì)檸檬醛P.funiculosum生長(zhǎng)抑制結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 濾紙片法檢測(cè)不同濃度檸檬醛對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)的抑制作用Table1 Effect of different concentration of citral on growth inhibition by filter paper method of P.funiculosum at 25℃

表2 揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度檸檬醛對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)的抑制作用Table2 Effect of different concentration of citral on growth inhibition by volatile activity test method of P.funiculosum at 25℃

表2結(jié)果表明，不同濃度的檸檬醛揮發(fā)性成分對(duì)P.funiculosum生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用。在較低濃度（2.0 mg·mL-1）條件下，P.funiculosum的菌落直徑為1.51 cm，明顯低于對(duì)照（1.82 cm），其增長(zhǎng)率（202.67%）也比對(duì)照（262.67%）低。檸檬醛對(duì)其的抑制率為16.39%。隨著濃度增加，P.funiculosum的菌落直徑、菌落增長(zhǎng)率以及檸檬醛對(duì)其的生長(zhǎng)抑制率也隨之發(fā)生變化。在濃度為3.0 mg·mL-1時(shí)，菌落直徑為0.56 cm，相比對(duì)照與2.0 mg·mL-1條件下出現(xiàn)了明顯的下降，菌落增長(zhǎng)率也由200%以上降低到38.0%。同時(shí)抑制率升高，達(dá)到61.87%。當(dāng)濃度為4.0～6.0 mg·mL-1時(shí)，菌落基本無(wú)生長(zhǎng)，直徑處于0.50～0.54之間，變化無(wú)顯著性差異。菌落增長(zhǎng)率為0～8.67%，比對(duì)照（262.67%）降低約250%。生長(zhǎng)抑制率處于69.98%～72.19%之間，相比對(duì)照表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

將濃度為 3.0、4.0、5.0、6.0 mg·mL-1的平板，去掉封口膜，通風(fēng)24 h除去檸檬醛后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)的結(jié)果表明檸檬醛揮發(fā)性成分對(duì)于P.funiculosum的最小抑制濃度（MIC）為3.0 mg·mL-1。

2.2 檸檬醛處理不同時(shí)間對(duì)P.funiculosum孢子萌發(fā)的影響

在檸檬醛抑制P.funiculosum孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，用3.0 mg·mL-1檸檬醛處理孢子不同時(shí)間觀察孢子萌發(fā)率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，檸檬醛處理不同的時(shí)間長(zhǎng)度，對(duì)P.funiculosum孢子的萌發(fā)時(shí)間以及萌發(fā)率都有明顯的影響。萌發(fā)時(shí)間方面，處理10 min，即對(duì)其萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用，萌發(fā)時(shí)間從14 h（對(duì)照）延至20 h，延遲了6 h。而處理120 min的樣品直到24 h開(kāi)始才有極少量孢子開(kāi)始萌發(fā)，比對(duì)照延遲了10 h。另外，處理30～90 min的樣品在萌發(fā)時(shí)間的延遲上與處理10 min的樣品一致，都延遲6 h后才開(kāi)始萌發(fā)。

圖1 檸檬醛處理不同時(shí)間對(duì)P.funiculosum孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of different treatment time of citral on percent inhibition of spore germination of P.funiculosum at 25℃

從萌發(fā)率來(lái)看，到24 h檸檬醛10 min處理組的萌發(fā)率為67.3%，比對(duì)照組（89%）降低了21.7%。30～90 min處理組的萌發(fā)率分別為60.3%、44.8%和23.5%。而120 min處理組的萌發(fā)率僅為5.2%，比對(duì)照降低了83.8%。并且隨著檸檬醛處理時(shí)間的延長(zhǎng)，P.funiculosum孢子萌發(fā)率隨之下降。

3 討論與結(jié)論

檸檬醛是山蒼子精油中一種主要揮發(fā)性成分，具有廣譜的抗菌性。本文從濃度、作用方式與作用時(shí)間三個(gè)方面研究檸檬醛對(duì)P.funiculosum的抑制作用。以探索采用檸檬醛的運(yùn)用方式和效果。

防霉劑的運(yùn)用方法多種多樣，根據(jù)其種類特性不同可以采用直接與產(chǎn)品混合、表面噴涂、熏蒸和包埋緩釋等不同方式。濾紙片法是檢測(cè)各種直接接觸混合型防腐劑抑菌作用的常用方法。本文通過(guò)比較抑菌圈直徑的方法來(lái)比較不同濃度檸檬醛直接噴涂或者混合處理的方式對(duì)P.funiculosum的抑制作用。同時(shí)，基于檸檬醛的揮發(fā)性特點(diǎn)，采用揮發(fā)性活性物質(zhì)檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度檸檬醛對(duì)P.funiculosum的抑制作用，以探索熏蒸和包埋緩釋的運(yùn)用可能性與條件。

試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬醛揮發(fā)性成分對(duì)P.funiculosum的MIC為3.0 mg·mL-1，而濾紙片法所得MIC為6.0 mg·mL-1。二者結(jié)果不一致，前者M(jìn)IC低于后者。類似的結(jié)果在其他研究中也有報(bào)道[15]。另外，余伯良采用藥物平板法得到檸檬醛對(duì)A.flavus的最小抑制濃度（MIC）為 1.77 mg·mL-1[1]；張文平等采用藥敏板液體培養(yǎng)所得的結(jié)果為 2.590 μg·mL-1[17]；羅曼等的結(jié)果表明檸檬醛對(duì)A.flavus的MIC為0.5 μg·mL-1、最小致死濃度為 2.0 μg·mL-1[18]。這些結(jié)果上的區(qū)別，除了檢測(cè)方法本身的原因之外[15-16]，也從另一個(gè)角度表現(xiàn)出防霉劑使用劑量、方式對(duì)抑菌效果具有很大的影響。結(jié)合本文結(jié)果，相同低濃度下檸檬醛揮發(fā)性成分表現(xiàn)出比直接接觸更強(qiáng)的抑制作用。選擇采用低濃度熏蒸或包埋的方式，檸檬醛可能對(duì)P.funiculosum取得更好的抑制效果。

除了濃度與作用方式之外，作用時(shí)間也是防霉中的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)羅曼等的報(bào)道，檸檬醛在低濃度（0.5～2.0 μg·mL-1）條件下處理48 h，A.flavus孢子萌發(fā)率隨著濃度的增加而下降[18]。Sharma等采用其他植物精油對(duì)A.flavus孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)也得到類似的結(jié)果[15]。本文通過(guò)檸檬醛不同時(shí)間處理P.funiculosum孢子萌發(fā)率的影響，探索檸檬醛抑菌的最佳作用時(shí)間與效果。在最小抑制濃度下，處理60 min即可達(dá)到超過(guò)50%的孢子萌發(fā)抑制率，同時(shí)延遲萌發(fā)6 h。而處理2 h后對(duì)孢子萌發(fā)起到極大的抑制作用，孢子萌發(fā)率僅5.2%，萌發(fā)時(shí)間延遲10 h。因此，采用熏蒸的方式，檸檬醛作用時(shí)間2 h以上即可對(duì)P.funiculosum起到較好的抑制效果。當(dāng)然，在合適的濃度與作用時(shí)間之間的選擇并非完全不變，必須要根據(jù)實(shí)際作用方式與環(huán)境因素進(jìn)行選擇。

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