曾 曉，孫露霜，楊立琳，曹允考

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

Ran（Ras-related Nuclear）是小型的 Ras相關(guān)蛋白，Ran在所有已研究過的有機體中都存在，它們是生存所需要的基本物質(zhì)，對真核細胞中有絲分裂和減數(shù)分裂開始和結(jié)束的控制，及其間紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜破裂和重組等都起一定的作用[1]。Ran的作用是在其調(diào)節(jié)物RanGEF（Guanine Nucleotide Exchange Factors）、RanGAP1（RanGTPase Activating Protein 1）、RanBP1（Ran Binding Protein 1）和 RanBP2（Ran Binding Protein 2）等的調(diào)節(jié)下，Ran連接的GTP/GDP發(fā)生轉(zhuǎn)換實現(xiàn)的。RanBP1是其中的一個主要調(diào)節(jié)因子，目前國內(nèi)外有很多學(xué)者對其進行了大量的研究。

RanBP1是Ran家族最小的成員，是第一個被鑒定的Ran結(jié)合蛋白，最早是對CG-豐富的序列進行功能篩選中被克隆出來[2]。分子質(zhì)量為23 ku，由201個氨基酸構(gòu)成，沒有真正的GAP活性和功能，但可作為GEF抑制器使RCC1失活，間接增加RanGDP變?yōu)镽anGTP的比值。RanBP1可以被看作是RanGTPase循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，從酵母到人類都是高度保守的[3]。RanBP1對細胞的一些生物過程：如細胞的核-質(zhì)運輸、紡錘體的組裝、細胞周期、有絲分裂控制、有絲分裂結(jié)束后核重組等都有一定的作用。

1 RanBP1細胞的核質(zhì)間物質(zhì)運輸中的作用

真核細胞中離子、小的代謝物和分子質(zhì)量小于40～60 ku的蛋白質(zhì)能夠通過核孔復(fù)合物（Nuclear Pore Complex，NPC）環(huán)繞的水溶性通道來被動擴散。多數(shù)分子質(zhì)量大于40～60 ku的大分子蛋白以主動運輸?shù)男问酱┻^NPC。許多試驗證明，蛋白質(zhì)的主動內(nèi)輸和外運分別是由被稱為核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）和核外輸信號（Nuclear Export Signal，NES）的短氨基酸片段介導(dǎo)的。大量的研究表明，Ran的調(diào)節(jié)物在細胞中的空間定位可以使間期時的細胞核內(nèi)產(chǎn)生高濃度的RanGTP，而細胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的RanGTP濃度很低并且量是非常有限的，這種核內(nèi)與核外有較高的RanGTP濃度差是調(diào)節(jié)核質(zhì)轉(zhuǎn)運方向必須的[1]。

RanBP1作為Ran的重要調(diào)節(jié)因子也在其中起到一定作用。Rexach和Blobel用提純了的重組蛋白來進行連接分析的方法顯示RanGTP能使固定后的核蛋白釋放出由NLS、importinα（內(nèi)輸?shù)鞍爪粒┖蚷mportinβ（內(nèi)輸?shù)鞍爪拢?gòu)成的復(fù)合物，并使NLS/importinα從 importinβ上游離出來。RanGTP和importinβ直接連接，通過與RanBP1相互作用而保持穩(wěn)定。當RanGTP.importinβ.RanBP1與RanGAP1相作用時，RanBP1可刺激Ran連接的GTP水解成GDP，從而破壞復(fù)合物，使RanBP1被釋放出來，從而促進由 RanGDP、importinβ 和 importinα.NLS，以及與內(nèi)輸因子P10一起裝配成內(nèi)輸復(fù)合物[3]。

相反，富含亮氨酸的NES在高濃度的RanGTP中被CRM1識別，在核內(nèi)形成NES.CRM1.RanGTP三聚體復(fù)合物，這個三聚體復(fù)合物在不需要GTP水解的情況下從NPC轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。然后，在RanGAP1和RanBP1/RanBP2的作用下GTP水解，使三聚體解聚。

2 RanBP1隨細胞周期的變化

哺乳動物RanBP1基因的表達受細胞周期各時期的條件控制。RanBP1基因轉(zhuǎn)錄在分化和休眠的細胞中效率低，但在分裂活躍的細胞中效率高。類視色素受體家族的因子對它起控制作用[4]。RanBP1蛋白水平隨細胞周期變化而變化，從S期到M期增加，有絲分裂中期達到高峰，分裂末期突然降低。在間期細胞中，RanBP1大部分位于細胞質(zhì)中[5]。

與相同的組織學(xué)起源的未轉(zhuǎn)化細胞相比，轉(zhuǎn)化型細胞（Hela細胞）中的RanBP1mRNA和蛋白過表達。在一個周期正常的細胞中，RanBP1轉(zhuǎn)錄在中期調(diào)節(jié)物E2F和pRb的調(diào)控下，在G1/S點被激活[6]。進入S期后，在E2F/pRb直接控制下，發(fā)生高水平的RanBP1表達，同時，細胞周期進程中需要的許多其他基因也開始表達。這種類視色素受體和E2F/pRb通道的雙重控制表明，RanBP1在Ran網(wǎng)狀體系和有絲分裂裝置的之間起中樞調(diào)節(jié)作用。

3 RanBP1在紡錘體組裝中的作用

染色體分離依靠雙極紡錘體的活動，紡錘體由聚集的微管（MTs）組成。RanGTP和RCC1已被證明在MT形成中發(fā)揮積極作用，而過量的RanBP1，RanGAP1或者Ran突變體（T24N）抑制RCC1作用，進一步抑制MTs的形成和紡錘體組裝[7]。在無細胞的提取物中，這些影響明顯是不依賴于轉(zhuǎn)運的?；仡櫾谑箢惣毎薪獬绨滨}唑的抑制作用后所看到的結(jié)果，和在非洲爪蟾提取物的研究中所得出的作用機制是一致的。RanBP1水平升高，會擾亂在無細胞提取物中對MT形成起關(guān)鍵作用，依賴于RanGTP的相關(guān)作用，并且對噻氨酯噠唑去除后的MT生長和聚集的恢復(fù)有抑制作用。

有絲分裂在鼠類細胞的特征進一步表明，在整個細胞周期中，RanBP1過表達誘導(dǎo)多極紡錘體的產(chǎn)生。這些異常的紡錘體是由有絲分裂中心體內(nèi)聚力喪失引起的。尤其，RanBP1過剩導(dǎo)致紡錘體極的中心粒分離，分開的中心粒能夠各自組裝有功能的微管排列，產(chǎn)生功能性的紡錘體極。依賴于RanBP1的中心粒分離在有絲分裂中被誘導(dǎo)產(chǎn)生，這要求微管完整和有活性的Eg5（調(diào)節(jié)中心粒分離的驅(qū)動蛋白）參與。證明RanBP1過表達對有絲分裂期間中心體的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)特點的關(guān)鍵因子會具有干擾作用[8]，多極和單極的現(xiàn)象在整個有絲分裂過程直到細胞分裂的末期都能看到，出現(xiàn)染色體在每個極的分配不均等，或者分離失敗[5]。

4 RanBP1對有絲分裂的調(diào)節(jié)

RanBP1是哺乳動物細胞Ran網(wǎng)狀體系的細胞周期調(diào)節(jié)因子，從G2期到細胞分裂后期保持高水平的狀態(tài)表明，相對于細胞周期的早期階段，在有絲分裂細胞中依賴于Ran的相互作用的調(diào)節(jié)要求RanBP1的濃集增強。事實上，RanBP1在哺乳動物細胞有絲分裂中明顯起作用，因為，它的過表達引起多極紡錘體的形成，并破壞有絲分裂的結(jié)束，但是，抗RanBP1的特異性抗體注射致使有絲分裂MTs抵抗噻氨酯噠唑（Nocodazole,NOC）誘導(dǎo)的解聚作用并產(chǎn)生染色體分配錯誤。因此，RanBP1對紡錘體形成和動力學(xué)有調(diào)節(jié)作用，而且，它和Ran的比率對于被調(diào)控過程的下游區(qū)是至關(guān)重要的[9]。

很多試驗表明，RanBP1在有絲分裂的細胞質(zhì)中積聚。將抗RanBP1的抗體注入哺乳動物有絲分裂細胞中，觀察體內(nèi)進行有絲分裂的過程，在前期或前中期紡錘體形成不受影響，而且染色體在赤道板上的排列正常，這和非洲爪蟾中的研究結(jié)果一致，可是接下來的有絲分裂過程的分裂后期被嚴重推遲，進一步出現(xiàn)姐妹染色單體分離失敗或不完全分離[5]。

最新研究表明，在RanBP1被耗盡的細胞中，發(fā)生前中期的細胞分裂延遲，或出現(xiàn)細胞凋亡。仍有活力的細胞裝配形態(tài)正常的紡錘體，但這些紡錘體過于穩(wěn)定，不能對細胞周期調(diào)節(jié)蛋白B1（Cyclin-B1）進行補充，也不能對微管穩(wěn)定因子HURP（DLG7）向微管正末端的定位進行限制。RanBP1缺失不增加獨立染色體出現(xiàn)的頻率，經(jīng)常出現(xiàn)細胞分裂后期同源染色體的分離滯后。這些資料表明，RanBP1活性對調(diào)節(jié)微管功能特殊因子的正確定位是必須的，這種RanBP1活性的缺失增加以依賴于微管方式進行的非整倍性細胞增殖[9]。

RanBP1也有助于調(diào)整有絲分裂裝置的功能。RanBP1失活產(chǎn)生MTs過穩(wěn)定，并在有絲分裂中導(dǎo)致編程性細胞死亡。綜合微管穩(wěn)定藥物紫杉醇的作用，研究在轉(zhuǎn)化細胞自然發(fā)生的和紫杉酚誘導(dǎo)的凋亡過程中RanBP1的作用，研究表明，不考慮p53的水平，通過RNA干涉使RanBP1水平下調(diào)，使幾種轉(zhuǎn)化的細胞系發(fā)生編程性細胞死亡，但是在MCF-7乳腺癌細胞中，半胱天冬酶-3（細胞凋亡蛋白酶）缺失時這種反應(yīng)不發(fā)生。和RanBP1水平正?；蜉^高的細胞比較，RanBP1干涉的細胞對紫杉酚處理產(chǎn)生的細胞凋亡反應(yīng)增強，而這個反應(yīng)是依賴于細胞凋亡蛋白酶的。這些結(jié)果表明RanBP1在靶向作用于MT的藥物治療中有調(diào)節(jié)作用[10]。

5 RanBP1在有絲分裂結(jié)束后核重組中的作用

有絲分裂開始和有絲分裂過程的進行依賴于細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的顯著變化，包括核膜破裂和染色體凝集。相反，有絲分裂后期的核重建要求染色體解聚，核膜重新組裝和通過核膜的轉(zhuǎn)運恢復(fù)。Ran在這些事件中起到重要作用，而RanBP1的負調(diào)節(jié)破壞它們的進行。

RanBP1在哺乳動物細胞中過表達，除了擾亂有絲分裂之外，也產(chǎn)生形態(tài)異常的核和染色體凝集改變的情況。這些核表達與MPM2抗體反應(yīng)的有絲分裂磷酸化抗原決定基有關(guān)，而且通常排列成對，是異常的有絲分裂產(chǎn)物的代表。核異常情況包括均質(zhì)的固縮染色質(zhì)、有超濃縮斑點和邊緣不規(guī)則的核，以及不正常重組的核膜。核缺陷的細胞中突變型NES的過表達、輸出缺陷和RanBP1的產(chǎn)生更明顯。因此，異常高濃度的RanBP1持續(xù)存在，尤其是錯誤地定位于細胞核時會影響核的重建。這些結(jié)果表明，在細胞有絲分裂期到間期轉(zhuǎn)換時，Ran-BP1的水平下調(diào)對染色質(zhì)濃縮和功能性間期核重組來說是必要的[11]。

在哺乳動物細胞中，在有絲分裂結(jié)束后Ran-BP1的消失可能是一個間期核形成開始的關(guān)鍵信號。正如上面所論述的，RanBP1轉(zhuǎn)染細胞在有絲分裂結(jié)束時RanBP1持續(xù)高水平表達，染色質(zhì)去凝集失敗，也不能重組正常的核膜，這至少說明，RanGTP是活體內(nèi)需要的，與過量的RanT24N的爪蟾體系中看到的有缺陷的重構(gòu)核是一樣的。在RanBP1過表達的末期細胞中，沒有抑制Ran在細胞核中的重新定位，但出現(xiàn)了有絲分裂出口的不完善和間期核結(jié)構(gòu)的重建失敗，進一步反映Ran的功能被抑制。

[1]曹允考,張貴學(xué),陳大元,等.GTPaseRan及其生物學(xué)作用[J].細胞生物學(xué)雜志,2004,6(3):241-246.

[2]Bressan A,Somma M P,Lewis J,et al.Characterisation of the opposite-strand genes from the mouse bidirectionally transcribed Htf9 locus[J].Gene,1991,103:201-209.

[3]Bischoff F R,Krebber H,Smirnova E,et al.Co-activation of Ran-GTPase and inhibition of GTP dissociation by RanGTP binding protein RanBP1[J].EMBO J,1995,1:705-715.

[4]Di Matteo G,Salerno M,Guarguaglini G,et al.Interactions with single-stranded and double-stranded DNA-binding factors and alternative promoter conformation upon transcriptional activation of the Htf9-a/RanBP1 and Htf9-c genes[J].J Biol Chem,1998,273:495-505.

[5]Guarguaglini G,Renzi L,Ottavio F,et al.Regulated Ran-binding protein 1 activity is required for organization and function of the mitotic spindle in mammalian cells in vivo[J].Cell Growth Differ,2000,11:455-465.

[6]Di Fiore B,Guarguaglini G,Palena A,et al.Two E2F-binding sites independently control growth-regulated and cell-cycle regulated transcription of the Htf9-a/RanBP1 gene[J].J Biol Chem,1999,274:10339-10348.

[7]Plafker K,Macara I G.Facilitated nucleocytoplasmic shuttling of the Ran binding protein RanBP1[J].Mol Cell Biol,2000,20:3510-3521.

[8]Di Fiore B,Ciciarello I,Iangiacasale R,et al.Mammalian RanBP1 regulates centrosome cohesion during mitosis[J].J Cell Sci,2003,116:3399-3411.

[9]Tedeschi A,Ciciarello M,Manqizcasale R,et al.RanBP1 localizes a subset of mitotic regulatory factor on spindle microtubules and regulateschromosomesegregationinhumancells[J].J Cell Sci,2007,120:3748-3761.

[10]Rensen W M,Roscioli E,Tedeschi A,et al.RanBP1 downregulation sensitizes cancer cells to taxol in a caspase-3-dependent manner[J].Oncogene,2009,10:1038-1039.

[11]Baumer M,Kunzler M,Steigemann P,et al.Yeast Ran-binding protein Yrb1p is required for efficient proteolysis of cell cycle regulatory proteins Pds1p and Sic1p[J].J Biol Chem,2000,275:38929-38937.