曾 曉,孫露霜,楊立琳,曹允考
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)
Ran(Ras-related Nuclear)是小型的 Ras相關(guān)蛋白,Ran在所有已研究過(guò)的有機(jī)體中都存在,它們是生存所需要的基本物質(zhì),對(duì)真核細(xì)胞中有絲分裂和減數(shù)分裂開(kāi)始和結(jié)束的控制,及其間紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜破裂和重組等都起一定的作用[1]。Ran的作用是在其調(diào)節(jié)物RanGEF(Guanine Nucleotide Exchange Factors)、RanGAP1(RanGTPase Activating Protein 1)、RanBP1(Ran Binding Protein 1)和 RanBP2(Ran Binding Protein 2)等的調(diào)節(jié)下,Ran連接的GTP/GDP發(fā)生轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的。RanBP1是其中的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因子,目前國(guó)內(nèi)外有很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究。
RanBP1是Ran家族最小的成員,是第一個(gè)被鑒定的Ran結(jié)合蛋白,最早是對(duì)CG-豐富的序列進(jìn)行功能篩選中被克隆出來(lái)[2]。分子質(zhì)量為23 ku,由201個(gè)氨基酸構(gòu)成,沒(méi)有真正的GAP活性和功能,但可作為GEF抑制器使RCC1失活,間接增加RanGDP變?yōu)镽anGTP的比值。RanBP1可以被看作是RanGTPase循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,從酵母到人類(lèi)都是高度保守的[3]。RanBP1對(duì)細(xì)胞的一些生物過(guò)程:如細(xì)胞的核-質(zhì)運(yùn)輸、紡錘體的組裝、細(xì)胞周期、有絲分裂控制、有絲分裂結(jié)束后核重組等都有一定的作用。
真核細(xì)胞中離子、小的代謝物和分子質(zhì)量小于40~60 ku的蛋白質(zhì)能夠通過(guò)核孔復(fù)合物(Nuclear Pore Complex,NPC)環(huán)繞的水溶性通道來(lái)被動(dòng)擴(kuò)散。多數(shù)分子質(zhì)量大于40~60 ku的大分子蛋白以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)男问酱┻^(guò)NPC。許多試驗(yàn)證明,蛋白質(zhì)的主動(dòng)內(nèi)輸和外運(yùn)分別是由被稱(chēng)為核定位信號(hào)(Nuclear Localization Signal,NLS)和核外輸信號(hào)(Nuclear Export Signal,NES)的短氨基酸片段介導(dǎo)的。大量的研究表明,Ran的調(diào)節(jié)物在細(xì)胞中的空間定位可以使間期時(shí)的細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生高濃度的RanGTP,而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的RanGTP濃度很低并且量是非常有限的,這種核內(nèi)與核外有較高的RanGTP濃度差是調(diào)節(jié)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方向必須的[1]。
RanBP1作為Ran的重要調(diào)節(jié)因子也在其中起到一定作用。Rexach和Blobel用提純了的重組蛋白來(lái)進(jìn)行連接分析的方法顯示RanGTP能使固定后的核蛋白釋放出由NLS、importinα(內(nèi)輸?shù)鞍爪粒┖蚷mportinβ(內(nèi)輸?shù)鞍爪拢?gòu)成的復(fù)合物,并使NLS/importinα從 importinβ上游離出來(lái)。RanGTP和importinβ直接連接,通過(guò)與RanBP1相互作用而保持穩(wěn)定。當(dāng)RanGTP.importinβ.RanBP1與RanGAP1相作用時(shí),RanBP1可刺激Ran連接的GTP水解成GDP,從而破壞復(fù)合物,使RanBP1被釋放出來(lái),從而促進(jìn)由 RanGDP、importinβ 和 importinα.NLS,以及與內(nèi)輸因子P10一起裝配成內(nèi)輸復(fù)合物[3]。
相反,富含亮氨酸的NES在高濃度的RanGTP中被CRM1識(shí)別,在核內(nèi)形成NES.CRM1.RanGTP三聚體復(fù)合物,這個(gè)三聚體復(fù)合物在不需要GTP水解的情況下從NPC轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。然后,在RanGAP1和RanBP1/RanBP2的作用下GTP水解,使三聚體解聚。
哺乳動(dòng)物RanBP1基因的表達(dá)受細(xì)胞周期各時(shí)期的條件控制。RanBP1基因轉(zhuǎn)錄在分化和休眠的細(xì)胞中效率低,但在分裂活躍的細(xì)胞中效率高。類(lèi)視色素受體家族的因子對(duì)它起控制作用[4]。RanBP1蛋白水平隨細(xì)胞周期變化而變化,從S期到M期增加,有絲分裂中期達(dá)到高峰,分裂末期突然降低。在間期細(xì)胞中,RanBP1大部分位于細(xì)胞質(zhì)中[5]。
與相同的組織學(xué)起源的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)化型細(xì)胞(Hela細(xì)胞)中的RanBP1mRNA和蛋白過(guò)表達(dá)。在一個(gè)周期正常的細(xì)胞中,RanBP1轉(zhuǎn)錄在中期調(diào)節(jié)物E2F和pRb的調(diào)控下,在G1/S點(diǎn)被激活[6]。進(jìn)入S期后,在E2F/pRb直接控制下,發(fā)生高水平的RanBP1表達(dá),同時(shí),細(xì)胞周期進(jìn)程中需要的許多其他基因也開(kāi)始表達(dá)。這種類(lèi)視色素受體和E2F/pRb通道的雙重控制表明,RanBP1在Ran網(wǎng)狀體系和有絲分裂裝置的之間起中樞調(diào)節(jié)作用。
染色體分離依靠雙極紡錘體的活動(dòng),紡錘體由聚集的微管(MTs)組成。RanGTP和RCC1已被證明在MT形成中發(fā)揮積極作用,而過(guò)量的RanBP1,RanGAP1或者Ran突變體(T24N)抑制RCC1作用,進(jìn)一步抑制MTs的形成和紡錘體組裝[7]。在無(wú)細(xì)胞的提取物中,這些影響明顯是不依賴(lài)于轉(zhuǎn)運(yùn)的?;仡櫾谑箢?lèi)細(xì)胞中解除噻氨酯噠唑的抑制作用后所看到的結(jié)果,和在非洲爪蟾提取物的研究中所得出的作用機(jī)制是一致的。RanBP1水平升高,會(huì)擾亂在無(wú)細(xì)胞提取物中對(duì)MT形成起關(guān)鍵作用,依賴(lài)于RanGTP的相關(guān)作用,并且對(duì)噻氨酯噠唑去除后的MT生長(zhǎng)和聚集的恢復(fù)有抑制作用。
有絲分裂在鼠類(lèi)細(xì)胞的特征進(jìn)一步表明,在整個(gè)細(xì)胞周期中,RanBP1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)多極紡錘體的產(chǎn)生。這些異常的紡錘體是由有絲分裂中心體內(nèi)聚力喪失引起的。尤其,RanBP1過(guò)剩導(dǎo)致紡錘體極的中心粒分離,分開(kāi)的中心粒能夠各自組裝有功能的微管排列,產(chǎn)生功能性的紡錘體極。依賴(lài)于RanBP1的中心粒分離在有絲分裂中被誘導(dǎo)產(chǎn)生,這要求微管完整和有活性的Eg5(調(diào)節(jié)中心粒分離的驅(qū)動(dòng)蛋白)參與。證明RanBP1過(guò)表達(dá)對(duì)有絲分裂期間中心體的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的關(guān)鍵因子會(huì)具有干擾作用[8],多極和單極的現(xiàn)象在整個(gè)有絲分裂過(guò)程直到細(xì)胞分裂的末期都能看到,出現(xiàn)染色體在每個(gè)極的分配不均等,或者分離失敗[5]。
RanBP1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞Ran網(wǎng)狀體系的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,從G2期到細(xì)胞分裂后期保持高水平的狀態(tài)表明,相對(duì)于細(xì)胞周期的早期階段,在有絲分裂細(xì)胞中依賴(lài)于Ran的相互作用的調(diào)節(jié)要求RanBP1的濃集增強(qiáng)。事實(shí)上,RanBP1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂中明顯起作用,因?yàn)?,它的過(guò)表達(dá)引起多極紡錘體的形成,并破壞有絲分裂的結(jié)束,但是,抗RanBP1的特異性抗體注射致使有絲分裂MTs抵抗噻氨酯噠唑(Nocodazole,NOC)誘導(dǎo)的解聚作用并產(chǎn)生染色體分配錯(cuò)誤。因此,RanBP1對(duì)紡錘體形成和動(dòng)力學(xué)有調(diào)節(jié)作用,而且,它和Ran的比率對(duì)于被調(diào)控過(guò)程的下游區(qū)是至關(guān)重要的[9]。
很多試驗(yàn)表明,RanBP1在有絲分裂的細(xì)胞質(zhì)中積聚。將抗RanBP1的抗體注入哺乳動(dòng)物有絲分裂細(xì)胞中,觀察體內(nèi)進(jìn)行有絲分裂的過(guò)程,在前期或前中期紡錘體形成不受影響,而且染色體在赤道板上的排列正常,這和非洲爪蟾中的研究結(jié)果一致,可是接下來(lái)的有絲分裂過(guò)程的分裂后期被嚴(yán)重推遲,進(jìn)一步出現(xiàn)姐妹染色單體分離失敗或不完全分離[5]。
最新研究表明,在RanBP1被耗盡的細(xì)胞中,發(fā)生前中期的細(xì)胞分裂延遲,或出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。仍有活力的細(xì)胞裝配形態(tài)正常的紡錘體,但這些紡錘體過(guò)于穩(wěn)定,不能對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B1(Cyclin-B1)進(jìn)行補(bǔ)充,也不能對(duì)微管穩(wěn)定因子HURP(DLG7)向微管正末端的定位進(jìn)行限制。RanBP1缺失不增加獨(dú)立染色體出現(xiàn)的頻率,經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞分裂后期同源染色體的分離滯后。這些資料表明,RanBP1活性對(duì)調(diào)節(jié)微管功能特殊因子的正確定位是必須的,這種RanBP1活性的缺失增加以依賴(lài)于微管方式進(jìn)行的非整倍性細(xì)胞增殖[9]。
RanBP1也有助于調(diào)整有絲分裂裝置的功能。RanBP1失活產(chǎn)生MTs過(guò)穩(wěn)定,并在有絲分裂中導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡。綜合微管穩(wěn)定藥物紫杉醇的作用,研究在轉(zhuǎn)化細(xì)胞自然發(fā)生的和紫杉酚誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中RanBP1的作用,研究表明,不考慮p53的水平,通過(guò)RNA干涉使RanBP1水平下調(diào),使幾種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系發(fā)生編程性細(xì)胞死亡,但是在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中,半胱天冬酶-3(細(xì)胞凋亡蛋白酶)缺失時(shí)這種反應(yīng)不發(fā)生。和RanBP1水平正?;蜉^高的細(xì)胞比較,RanBP1干涉的細(xì)胞對(duì)紫杉酚處理產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡反應(yīng)增強(qiáng),而這個(gè)反應(yīng)是依賴(lài)于細(xì)胞凋亡蛋白酶的。這些結(jié)果表明RanBP1在靶向作用于MT的藥物治療中有調(diào)節(jié)作用[10]。
有絲分裂開(kāi)始和有絲分裂過(guò)程的進(jìn)行依賴(lài)于細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的顯著變化,包括核膜破裂和染色體凝集。相反,有絲分裂后期的核重建要求染色體解聚,核膜重新組裝和通過(guò)核膜的轉(zhuǎn)運(yùn)恢復(fù)。Ran在這些事件中起到重要作用,而RanBP1的負(fù)調(diào)節(jié)破壞它們的進(jìn)行。
RanBP1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá),除了擾亂有絲分裂之外,也產(chǎn)生形態(tài)異常的核和染色體凝集改變的情況。這些核表達(dá)與MPM2抗體反應(yīng)的有絲分裂磷酸化抗原決定基有關(guān),而且通常排列成對(duì),是異常的有絲分裂產(chǎn)物的代表。核異常情況包括均質(zhì)的固縮染色質(zhì)、有超濃縮斑點(diǎn)和邊緣不規(guī)則的核,以及不正常重組的核膜。核缺陷的細(xì)胞中突變型NES的過(guò)表達(dá)、輸出缺陷和RanBP1的產(chǎn)生更明顯。因此,異常高濃度的RanBP1持續(xù)存在,尤其是錯(cuò)誤地定位于細(xì)胞核時(shí)會(huì)影響核的重建。這些結(jié)果表明,在細(xì)胞有絲分裂期到間期轉(zhuǎn)換時(shí),Ran-BP1的水平下調(diào)對(duì)染色質(zhì)濃縮和功能性間期核重組來(lái)說(shuō)是必要的[11]。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,在有絲分裂結(jié)束后Ran-BP1的消失可能是一個(gè)間期核形成開(kāi)始的關(guān)鍵信號(hào)。正如上面所論述的,RanBP1轉(zhuǎn)染細(xì)胞在有絲分裂結(jié)束時(shí)RanBP1持續(xù)高水平表達(dá),染色質(zhì)去凝集失敗,也不能重組正常的核膜,這至少說(shuō)明,RanGTP是活體內(nèi)需要的,與過(guò)量的RanT24N的爪蟾體系中看到的有缺陷的重構(gòu)核是一樣的。在RanBP1過(guò)表達(dá)的末期細(xì)胞中,沒(méi)有抑制Ran在細(xì)胞核中的重新定位,但出現(xiàn)了有絲分裂出口的不完善和間期核結(jié)構(gòu)的重建失敗,進(jìn)一步反映Ran的功能被抑制。
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