段惠潔，郭敏芳，尉杰忠，梁麗云，馬存根*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原 030001；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009)

鹽酸法舒地爾抑制小鼠EAE作用及機(jī)制研究

段惠潔1，2，郭敏芳2，尉杰忠2，梁麗云2，馬存根1，2*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原 030001；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009)

目的探討鹽酸法舒地爾（Fasudil hydrochloride）對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的抑制作用和可能的機(jī)制.方法按平均體重將C57BL／6雌性小鼠分為EAE組、鹽酸法舒地爾治療組和佐劑組，用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35－55多肽（MOG35－55）誘導(dǎo)EAE模型，佐劑組以等量生理鹽水代替.治療組于免疫后6 d開始按50 mg／（kg·d）腹腔注射鹽酸法舒地爾，EAE組和佐劑組用等量的生理鹽水作為對(duì)照.比較各組小鼠的各種表現(xiàn)，并進(jìn)行癥狀評(píng)分.免疫后18～20 d取各組小鼠，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況，用ELISA法檢測(cè)并比較各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子INF－γ、IL－17、IL－10的水平.結(jié)果鹽酸法舒地爾能夠顯著改善EAE的癥狀，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎性浸潤(rùn)及髓鞘脫失等病理變化，并且可抑制脾臟淋巴細(xì)胞分泌INF－γ、IL－17（P＜0.05），促進(jìn)IL－10的分泌（P＜0.05）.結(jié)論鹽酸法舒地爾可以有效抑制小鼠EAE，這種抑制可能與其對(duì)脾淋巴細(xì)胞中INF－γ、IL－17表達(dá)的下調(diào)和IL－10表達(dá)的上調(diào)作用有關(guān).

鹽酸法舒地爾 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 INF－γ IL－17 IL－10

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎性脫髓鞘病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?MS的病因和發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，與遺傳、免疫、病毒感染等均有關(guān)聯(lián)，但其確切機(jī)制尚未完全清晰.探討MS的免疫學(xué)機(jī)制一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn).MS具有免疫學(xué)基礎(chǔ)的更多證據(jù)來自于動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究.EAE是由特異性致敏的CD4＋T細(xì)胞介導(dǎo)的發(fā)生于敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自身免疫性疾病，而細(xì)胞因子的生成和調(diào)節(jié)是CD4＋T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)作用的主要機(jī)制.CD4＋T細(xì)胞通常按照其分泌的細(xì)胞因子的不同，分為Th1和Th2兩種亞型.Th1型細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ等細(xì)胞因子，介導(dǎo)與炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，具有促炎性作用；Th2細(xì)胞分泌IL－10等細(xì)胞因子，對(duì)EAE和MS的病情有抑制作用[1]；IFN－γ可誘導(dǎo)Th1分化，抑制Th2細(xì)胞增殖[2].總之，在EAE和MS的病情演化中，由細(xì)胞因子構(gòu)成的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)其發(fā)生、發(fā)展以及緩解起著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用[3].

研究表明Rho激酶－II（ROCK－Ⅱ）特異抑制劑——鹽酸法舒地爾（Fasudil hydrochloride）通過減少外周淋巴細(xì)胞活化和遷移進(jìn)入CNS，消除CNS的炎癥反應(yīng)；促進(jìn)神經(jīng)元胞體以及神經(jīng)軸突的再生等作用，可以緩解和改善EAE和MS的癥狀[4].本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Fasudil hydrochloride干預(yù)MOG35－55誘導(dǎo)的小鼠EAE，檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖以及分泌細(xì)胞因子的情況，探討Fasudil hydrochloride有效改善EAE的可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級(jí)C57BL／6雌性小鼠60只，年齡6～8周，體質(zhì)量 18～22 g，購(gòu)自北京維通利華公司；MOG35－55由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成，純度HPLC 97%；百日咳毒素（PTX）購(gòu)自北京畢特博生物技術(shù)有限公司；完全弗氏佐劑（CFA）購(gòu)自Sigma公司；鹽酸法舒地爾注射液為天津紅日藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng).

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及EAE模型制備

清潔級(jí)C57BL／6雌性小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按平均體質(zhì)量分為3組，即EAE組（20只），法舒地爾治療組（20只）和佐劑組（20只）.用生理鹽水將MOG33－35稀釋成終濃度為3 mg／mL，用完全弗氏佐劑（CFA）將結(jié)核桿菌（TB）稀釋成終濃度為3.5 mg／mL，然后將二者等體積混合，用注射器打成油包水狀，制成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑，按每只0.1 mL劑量，對(duì)EAE組和治療組小鼠給予免疫.方法是于小鼠背部后區(qū)中線兩側(cè)選取4個(gè)進(jìn)針點(diǎn)皮下注射，佐劑組以生理鹽水代替MOG33－35稀釋液制成乳劑同法注射.記免疫后（p.i.）當(dāng)日為d0p.i.，各組小鼠于d0p.i和d2p.i.分別給予腹腔注射百日咳毒素（PTX）700 ng／只，作為免疫增強(qiáng)劑.治療組于d6p.i.開始給予腹腔注射Fasudil hydrochloride 50 mg／（kg·d），每日一次，連續(xù)治療14 d，EAE組和佐劑組給予同等劑量生理鹽水.

1.2.2 臨床癥狀評(píng)分和體重變化

小鼠經(jīng)MOG免疫后，隔日采用盲法由兩名觀察者稱量并記錄每只小鼠的體重，采用國(guó)際通用的5分評(píng)分制對(duì)小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分，直至MOG免疫后40 d.評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無任何臨床癥狀；1分，尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2分，一側(cè)后下肢無力，被動(dòng)翻身后可以恢復(fù)；3分，雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動(dòng)；4分，雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡.癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5計(jì).

1.2.3 取材

于d18～20p.i.用3%戊巴比妥麻醉動(dòng)物，無菌取出脾臟后，生理鹽水心臟灌流，4%多聚甲醛灌流固定，解剖分離腦和脊髓，石蠟包埋做病理切片，行HE染色和Luxol Fast Blue髓鞘染色.

1.2.4 脾淋巴細(xì)胞的分離與制備

于d18～20 p.i.各組取8只小鼠，麻醉后75%酒精皮膚消毒，無菌取出脾臟，剪碎，用注射器針芯研磨，400目尼龍濾網(wǎng)過濾，置于 15 mL離心管，加入已消毒預(yù)冷的PBS中，1 200 r／min離心5 min，棄上清，再加入PBS，反復(fù)吹打重懸后再次離心，PBS洗3次，棄上清，按2 mL／管加入已消毒預(yù)冷的雙蒸水，低滲裂解紅細(xì)胞，45 s后按 1 mL／管快速加入已消毒預(yù)冷的2.7 mg／100 mL的NaCl，使還原為等滲，用已消毒預(yù)冷的 PBS補(bǔ)充體積至10 mL左右，1 200 r／min離心5 min，棄上清，重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)液（高糖DMEM，5%的胎牛血清，100 U／mL青霉素－鏈霉素）將各管細(xì)胞密度調(diào)整至 1×109／L，接種在 96孔板中，200 μL／孔細(xì)胞懸液，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育.

1.2.5 MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖

脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集上清液，－20℃凍存.之后每孔加入MTT（5 g／L）35 μL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔.37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸干液體，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩10～15 min使紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490值.

1.2.6 脾淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的檢測(cè)

96孔板中分別加入50 μL的捕獲抗體，4℃過夜；次日用洗滌緩沖液洗4次后分別加入70 μL封閉液，室溫封閉1 h；洗滌液洗滌4次，加入待測(cè)上清液，每板設(shè)2個(gè)空白對(duì)照孔，各加入50 μL DMEM不完全培養(yǎng)液，室溫2 h；洗滌緩沖液洗4次，加入相應(yīng)的檢測(cè)抗體，室溫下孵育1 h；洗滌緩沖液洗滌3次，加入50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素，室溫下孵育45 min；用洗滌液清洗5次后，加入酶作用底物，室溫孵育15～20 min底物顯色后，加入50 μL終止液，測(cè)定A450值.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況

EAE組小鼠從d11p.i.開始陸續(xù)發(fā)病，逐漸出現(xiàn)飲食量及活動(dòng)量減少、反應(yīng)遲鈍等，發(fā)病當(dāng)日體重明顯下降，臨床表現(xiàn)先是出現(xiàn)尾部肌張力低下，繼而進(jìn)展為雙側(cè)后肢無力甚至癱瘓，不能主動(dòng)翻身，d18p.i.左右癥狀達(dá)高峰，平均臨床癥狀評(píng)分（2.571±0.690），發(fā)病率達(dá)85%.與EAE組相比，治療組小鼠起病晚，高峰期延遲，癥狀較輕，發(fā)病率低，體重減輕程度明顯改善.見表1.

2.2 病理改變：

HE染色顯示EAE組小鼠脊髓炎性浸潤(rùn)主要分布在脊髓前角白質(zhì)、灰白質(zhì)交界區(qū)及正中裂血管周圍，浸潤(rùn)細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，尤以腰膨大炎性浸潤(rùn)比較明顯，而Fasudil hydrochloride治療組炎性浸潤(rùn)明顯減輕（圖1）.EAE組髓鞘染色可見髓鞘稀疏，不連續(xù)，而治療組髓鞘脫失表現(xiàn)有明顯改善（圖2）.佐劑組小鼠脊髓未見明顯異常改變.

表1 各組小鼠發(fā)病情況

2.3 脾淋巴細(xì)胞的增殖情況

d18～20檢測(cè)各組脾淋巴細(xì)胞的增殖情況.與對(duì)照組相比，EAE組脾臟淋巴細(xì)胞增殖作用明顯（P＜0.01）；Fasudil hydrochloride治療組淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯受抑制（P＜0.01，表2）.

2.4 脾淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)各組脾淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子INF－γ、IL－17、IL－10進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EAE組三種細(xì)胞因子的分泌均有增加，鹽酸法舒地爾明顯抑制IFN－γ、IL－17的分泌，并且促進(jìn)IL－10的分泌（圖3）.

圖1 HE染色情況（脊髓HE染色：A、B、C圖×10，D、E、F圖×40）

圖2 髓鞘染色情況（脊髓髓鞘染色：1、2、3圖×10，4、5、6圖×40）

表2 MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果

圖3 各組脾臟淋巴細(xì)胞上清液中INF－γ、IL－17、IL－10水平

3 討論

EAE在整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程中存在著Th1／Th2細(xì)胞偏移，并以激活的Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象.Th1／Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在效應(yīng)T細(xì)胞增殖、分化和作用過程中起著關(guān)鍵作用[5].Th1細(xì)胞主要分泌IFN－γ、TNF－α等細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，引發(fā)和加重EAE；Th2細(xì)胞則主要分泌IL－00、HD－4等細(xì)胞因子；對(duì)EAE有抑制作用[6].IL－1是由IL－23（p40p19）誘導(dǎo)生成的Th17細(xì)胞分泌，在MS／EAE中，IL－23／Th17軸起著更為重要的角色.Kebir等[7]發(fā)現(xiàn)MS病人血腦屏障（bloodbrain）n－barrier，BBB）細(xì)胞表達(dá)IL－17和IL－23受體并且體內(nèi)外IL－17和IL－23均可以誘導(dǎo)BBB內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ACL2，CCL2與Th17細(xì)胞表面相應(yīng)的趨化因子CCR2受體結(jié)合后，破壞緊密連接，有效地通過BBB進(jìn)入CNS，引起CNS炎性改變.

Rho／Rho激酶（Rock）信號(hào)途徑是機(jī)體各組織中普遍存在的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、移行以及生成和死亡等.Rho／Rock信號(hào)途徑伴隨多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子受體后耦聯(lián)機(jī)制的活化而激活，通過激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接參與細(xì)胞內(nèi)微絲骨架構(gòu)型的調(diào)控，通過改變細(xì)胞骨架構(gòu)型而介導(dǎo)多種刺激，是細(xì)胞行為改變最直接的信號(hào)通路.Rho激酶能被多種細(xì)胞因子（cytokine，CK）活化，有研究表明，經(jīng)Rock－Ⅱ特異抑制劑——法舒地爾治療EAE后，IL－17和Th1類CK，如IFN－γ等明顯減少，而Th2類CK，如IL－4，IL－5有輕微的增加，導(dǎo)致IFN－γ／IL－4率明顯降低，這些結(jié)果和其他Rock抑制劑如Y－27632的結(jié)果一致.本研究顯示，在EAE發(fā)病高峰期培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞，檢測(cè)三組上清液中INF－γ、IL－17、IL－10的分泌，發(fā)現(xiàn)法舒地爾治療組與EAE組相比INF－γ的分泌顯著下調(diào)，IL－17分泌也有下調(diào)但不如 INF－γ明顯，IL－10的分泌顯著上調(diào)，推測(cè)Rock－Ⅱ特異抑制劑法舒地爾參與EAE發(fā)病高峰期Th1／Th2細(xì)胞向Th2的偏移.

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Rock－Ⅱ特異抑制劑——Fasudil hydrochloride（d6p.i.給予腹腔注射，連續(xù)給藥14 d）可以顯著降低由MOG35－55誘導(dǎo)的EAE小鼠的發(fā)病率，改善臨床癥狀，減輕炎性浸潤(rùn)及髓鞘脫失等病理變化，推測(cè)可能是與Rock－Ⅱ特異抑制劑對(duì)外周脾臟淋巴細(xì)胞增殖的直接抑制和T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān).Sun等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)，直接應(yīng)用Fasudil對(duì)EAE有很好的治療效果，不僅使外周特異性淋巴細(xì)胞減少，而且下調(diào)了IL－17和 IFN－γ／IL－4的比率.Rho／Rock信號(hào)途徑與MS和EAE的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，但是現(xiàn)有的資料仍不能清晰地證明其分子基礎(chǔ)和細(xì)胞靶點(diǎn).這些問題的闡明將對(duì)探討EAE和MS的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療方法具有特別重要的意義.

[1]Amy E J,Peter H,Cheryl M B,et al.Kinetics and cellular origin of cytokines in the central nervous system:insight into mechanisms of myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol，2000,164 (1):419-426.

[2]Khoruts A,Miller S D.Neuroantigen-specific Th2 cells are inefficient suppressors of experimental autoimmune encephalomyelitis induced by effector Th1 cells[J].J Immunol，1995,155:5011-5017

[3]Imitola J,Chitnis T,Khoury S J.Cytokines in multiple sclerosis:from bench to bedside[J].Pharmacol Ther，2005,106(2):163-177.

[4]Lingor P,Teusch N,Schwarz K,et al.Inhibition of Rho kinase(ROCK)increases neurite outgrowth on chondroitin sulphate proteoglycan in vitro and axonal regeneration in the adult optic nerve in vivo[J].J Neurochem，2007,103(1):181-189.

[5]McGeachy M J,Anderton S M.Cytokines in the induction and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Cytokines,2005,32(2):81-84.

[6]尉杰忠,孫永勝,馬存根,等.細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎耐受中的作用[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志,2006,29(3):160-164.

[7]Kebir H,Kreymborg K,Ifergan I,et al.Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation[J].Nat Med，2007,13(10):1173-1175.

[8]Sun X,Minohara M,Kikuchi H,et al.The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol，2006,180(1-2):126-134.

Abstract：ObjectiveTo investigate the suppressive effect and the possible mechanism of Fasudil hydrochloride on Experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）mice.MethodsAll female C57BL／6 mice were divided by average body weight into EAE group，F(xiàn)asudil hydrochloride treated group and Adjuvant group.Mice in EAE and treated groups were immunized subcutaneously with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（MOG35－55）.At the same time，adjuvant group was injected with normal saline instead of MOG35－55.Fasudil hydrochloride was intraperitoneally injected in the dosage of 50 mg（kg·d）in treated group on day 6 post－immunization（p.i），and mice in EAE and adjuvant group injected with normal saline as control.Manifestations of each groups were observed and compared.On day 18p.i，splenic lymphocytes were isolated under asepsis in each group respectively，and splenic lymphocyte suspensions were prepared.The proliferation assay was determined by MTT，and the supernatants were harvested for the detection of INF－γ，IL－17 and IL－10 by ELISA.ResultsFasudil hydrochloride may significant ameliorate symptoms of EAE mice，lessen inflammatory cell infiltration and demyelination，suppress the secretion of INF－γ，IL－17（P＜0.05）and promote the secretion of IL－10（P＜0.05）.ConclusionsFasudil hydrochloride can actively suppress EAE，which perhaps relates to downregulation of INF－γ，IL－17 and up－regulation of IL－10.

Key words：Fasudil hydrochloride；experimental autoimmune encephalomyelitis；interferon－γ；interleukin－17；interleukin－10

〔編輯 楊德兵〕

Effect and Mechanism of Fasudil Hydrochloride on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mice

DUAN Hui－jie1，2，GUO Min－fang1，YU Jie－zhong1，LIANG Li－yun1，MA Cun－gen1，2
（1.Institute of Brain Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009；2.Department of Neurology，the First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi，030001）

R744.5＋.1

A

1674-0874(2010)04-0053-05

2010－03－20

人事部2006年度回國(guó)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目［國(guó)人廳發(fā)（2006）164號(hào)］；山西省自然科學(xué)基金［2008011082－1］；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研基金［2007－50］；山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（青年）［2009021041－2］

段惠潔（1981－），女，山西省新絳縣人，在讀碩士，研究方向：神經(jīng)免疫學(xué)；*馬存根，博士，教授，通信作者.