岳志勁,關(guān)翠林,王海青,孟雙明,郭 永

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山西大同037009)

RP-HPLC法測(cè)定柴胡中四種黃酮類成分的含量

岳志勁,關(guān)翠林,王海青,孟雙明,郭 永

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山西大同037009)

建立反相高效液相色譜法測(cè)定柴胡中蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種黃酮類成分的含量.采用Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)分離樣品，以0.5%的磷酸溶液-甲醇(63:37)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)333 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL.結(jié)果顯示柴胡中四種黃酮類藥物達(dá)到了完全分離，線性范圍1～10 μg，平均回收率在91.2%～96.3%之間，RSD分別為為1.6%，2.1%，3.0%和1.1%(n=3).

柴胡 蘆丁 曲克蘆丁 黃芩苷槲皮素 反相高效液相色譜

柴胡屬傘形科植物，多年生草本，以根及全草入藥，是我國(guó)大宗緊缺藥材之一.它味苦、辛，性平，具有和解表里、舒肺解郁、升舉陽(yáng)氣的功能，主治疏散退熱、胸肋脹疼、月經(jīng)不調(diào)等癥[1].柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油(柴胡醇、丁香酚等)、脂肪油(油酸、亞麻油酸、棕櫚酸、硬脂酸等)和多糖等，此外，還含有生物堿、黃酮類、山萘苷、葡萄糖、氨基酸等.其中黃酮類化合物對(duì)人體腫瘤、衰老、心血管等疾病的治療和預(yù)防有重要意義[2].如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變，和降低毛細(xì)血管異常通透性及脆性的作用[3],臨床上用于治療過(guò)敏性紫癜及各種因毛細(xì)血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等[4].曲克蘆丁是蘆丁在堿性條件下與環(huán)氧乙烷進(jìn)行醚化反應(yīng)得到的羥乙基蘆丁的有效成分，能降低毛細(xì)血管的通透性和脆性，并有抑制血小板凝結(jié)，防止血栓形成的作用，是臨床上治療閉塞性腦血管病的常用藥物[5].黃芩苷具有清熱解毒，擴(kuò)張心腦血管，改善體內(nèi)微循環(huán)等作用[6].槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性及藥理作用，對(duì)呼吸道疾病，特別是對(duì)哮喘病和支氣管疾病有較好的作用[7].

目前已報(bào)道的測(cè)定黃酮類藥物的方法很多，主要有化學(xué)發(fā)光分析法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相

色譜法[10-11]、分光光度法[12]、等吸收紫外光度法[4]等，但一般都是分析一種或兩種黃酮類成分，同時(shí)分析蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種成分還未見(jiàn)報(bào)道.本文采用反相高效液相色譜法，同時(shí)分離和測(cè)定了柴胡中蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷和槲皮素四種黃酮類成分的含量.操作方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為柴胡中黃酮類成分的含量測(cè)定和質(zhì)量監(jiān)控提供了科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

日本島津 (SHIMADZU)LC-10A高效液相色譜儀系統(tǒng)；CLASS-VP色譜工作站；Milli-Q純水器(Millipore公司)；HANGPING SB2200電子天平 (上海天平儀器廠)；0.45 μm微孔過(guò)濾器；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠).

蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200306)；曲克蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100416-200503)；黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110715-200514)；槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406)；柴胡 (產(chǎn)地：河北祁州，生產(chǎn)廠家：河北安國(guó)興旺制藥飲片公司).甲醇、乙腈為色譜純，水為Milli-Q純水器處理的超純水，其它試劑為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素對(duì)照品各10 mg于四支比色管中,用甲醇溶解并定容至10mL，配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL于一支10 mL比色管中，然后用甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.01 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液.測(cè)定時(shí)取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.2.2 供試品溶液的制備

柴胡用粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)4號(hào)篩，稱取5 g置于圓底燒瓶中，加70 mL乙醇和30 mL水回流2.5 h.待冷卻、過(guò)濾后，于78℃蒸餾回收乙醇.浸膏用水飽和的乙酸乙酯萃取3次(20:15:10)，合并乙酸乙酯層，于77℃蒸餾回收乙酸乙酯.殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0 mL比色管中，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得.

1.2.3 色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS柱 (150 mm×4.6mm，5 μm)；保護(hù)柱：Shim-packGVP-ODS柱(4.6 mm×10 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.5%的磷酸溶液-甲醇 (63:37)；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：333 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40℃.對(duì)照品和樣品的色譜圖見(jiàn)圖1.

1.2.4 線性關(guān)系考察

取適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋并定容于10 mL比色管中，配制濃度分別為10 μg·mL-1，5μg·mL-1，2.5 μg·mL-1和1 μg·mL-14個(gè)水平黃酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)混合液，每個(gè)溶液分別進(jìn)樣3次，以峰面積對(duì)濃度作工作曲線，用稀釋法測(cè)定四種黃酮類藥物的檢出限.四種黃酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表1，其中X表示黃酮類藥物的濃度，Y表示黃酮類藥物的峰面積.

圖1 對(duì)照品(A)和柴胡藥材(B)的高效液相色譜圖

表1 四種黃酮類藥物的回歸分析結(jié)果及線性范圍

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取柴胡樣品5 g，按1.1.2法操作制備供試品溶液，分別在1，2，3，4 d于上述色譜條件下測(cè)定，以峰面積計(jì)算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為2.1%，2.2%，3.5%，4.7%.結(jié)果顯示供試品溶液在4 d內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取柴胡樣品5 g共6份，按1.1.2法操作制備供試品溶液，于上述色譜條件下測(cè)定，以峰面積計(jì)算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.1%，3.5%，2.7%，4.3%.

1.2.7 精密度考察

取上述對(duì)照品溶液20 μL，按照上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.6%，2.1%，3.0%，1.1%..

1.2.8 回收率測(cè)定

取已知含量的柴胡供試品溶液各1 mL分別于三支10 mL比色管中，再分別加入4 μL，6 μL，8μL的1 mg·mL-1蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷，(槲皮素因含量較高，標(biāo)準(zhǔn)品加入量增加10倍)，配制成4 μg·mL-1，6 μg·mL-1，8 μg·mL-1的加標(biāo)溶液.在最佳色譜條件下進(jìn)樣，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率見(jiàn)表2.

表2 柴胡中黃酮類藥物的回收率(n=3)

1.2.9 樣品測(cè)定

將柴胡供試品溶液直接進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)柴胡中槲皮素含量較高，故采用單點(diǎn)校正法定量，其它三種組分含量較低，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 樣品中四種黃酮類成分含量測(cè)定(n=3)

2 討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

考察采用甲醇和水、甲醇和磷酸或磷酸鹽、乙腈和磷酸、四氫呋喃(THF)和磷酸五種不同體系作為流動(dòng)相時(shí)蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種黃酮成分的分離情況，結(jié)果表明：采用CH3OHKH2PO4(40:60)為流動(dòng)相時(shí)，黃芩苷和槲皮素拖尾比較嚴(yán)重；選擇H3PO4-CH3CN(54:46)為流動(dòng)相時(shí)，各組分分離情況不佳；當(dāng)用H3PO4-THF(67:33)為流動(dòng)相時(shí)，雖然峰形比較好，但蘆丁和曲克蘆丁分不開(kāi)；選擇CH3OH-H2O(37:63)為流動(dòng)相時(shí)柱壓很高；而選用CH3OH-H3PO4(37:63)時(shí)，峰形好又可以使四個(gè)組分在35 min內(nèi)達(dá)到完全分離，而且柱壓也不高.綜合考慮以上因素，最后選CH3OH-H3PO4(37: 63)為分離四種黃酮類藥物的流動(dòng)相.

2.2 流動(dòng)相中甲醇比例的選擇

考察流動(dòng)相中甲醇比例不同時(shí)，對(duì)四種黃酮組分保留時(shí)間的影響.以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示：隨著甲醇比例增加，流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，各組分的保留時(shí)間相應(yīng)縮短.當(dāng)甲醇比例超過(guò)37%時(shí)，各峰的峰形不太好；當(dāng)甲醇的比例小于37%時(shí)，流動(dòng)相極性減弱，各組分的保留時(shí)間相應(yīng)增加，導(dǎo)致分析時(shí)間大大延長(zhǎng)，且柱壓增大；當(dāng)甲醇比例為37%時(shí)，在35 min內(nèi)四種組分達(dá)到基線分離.

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取20 μL的0.01 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)樣，由紫外光譜可知：蘆丁在350 nm和260 nm時(shí)有最大吸收；曲克蘆丁在354 nm和255 nm時(shí)有最大吸收；黃芩苷在318 nm和274 nm處有最大吸收；槲皮素在370 nm和254 nm處有最大吸收.結(jié)果顯示：當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)小于333 nm時(shí)，溶劑峰較大，干擾大，影響測(cè)定的靈敏度；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)大于333 nm時(shí)，基線不穩(wěn)且黃芩苷的靈敏度較低.而在333 nm時(shí)，四種組分均有較靈敏的響應(yīng)，且干擾小，分離佳，便于檢測(cè)，因此選擇333 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

本方法重復(fù)性、精密度好，回收率符合要求，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可以為柴胡藥材的質(zhì)量監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Abstract:To establish a method for determining Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin in Radixbupleurichinensis by RPHPLC.The analysis was performed on Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm,5 μm)column with mobile phase contained phosphoric acid (0.5%)-methanol(63:37).The flow rate was 0.8 mL·min-1 and the detection wavelength was set at 333 nm.The temperature of column was 40℃and the injected volume was 20 μL.Under this condition,Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin could be completely separated.The lined range of four flavonoids was 1～10 μg,respectively.The average recovery of four flavoniods was 91.2%～96.3%,and the relative standard deviations of the method were 1.6%,2.1%,3.0%and 1.1%(n=3),respectively.The method is fast,simple,accurate and reliable which can be applied to the quality control of Radixbupleurichinensis.

Key words:Radixbupleurichinensis；Rutin；Troxerutin；Baicalin；Quercetin；RP-HPLC

〔編輯 楊德兵〕

RP-HPLC Determination of Four Flavonoids in Radixbupleurichinensis

YUE Zhi-jin，GUAN Cui-lin，WANG Hai-qing，MENG Shuang-ming,GUO Yong
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

R284.2

A

1674-0874(2010)04-0035-04

2010-05-03

山西大同大學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目[2008k6]

岳志勁(1971-)，女，山西大同人，碩士，講師，研究方向：分析化學(xué).