夏文進(jìn) 蘇丹 劉鵬 馬勝林 姜志明 張毅敏*

1.浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310003；2.浙江省腫瘤研究所，浙江 杭州 310022；3.浙江省腫瘤醫(yī)院放療科，*檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310022

毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥（ataxia-telangi-angiectasia，AT）發(fā)生的致病基因［1］。在損傷修復(fù)通路中，它是DNA損傷位點(diǎn)識別因子，它能檢測到損傷的DNA并激活一系列的修復(fù)反應(yīng)。ATM蛋白屬于PIK家族成員，離子輻射介導(dǎo)的DNA損傷是ATM激活的主要原因［2］。近年來，有許多研究［3-5］表明ATM基因的單核苷酸多態(tài)性會影響其功能，從而影響細(xì)胞對輻射的敏感性，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但以往的研究主要集中在ATM與乳腺癌和前列腺癌的相關(guān)性，與NSCLC相關(guān)性的研究并不多見。因此，本研究主要探討ATM基因單核苷酸多態(tài)性（rs664143，IVS62+60G＞A）是否與NSCLC的發(fā)生相關(guān)。

1 資料和方法

1.1 研究對象 2004年6月—2005年12月期間，從浙江省腫瘤醫(yī)院共收集資料完整的264例NSCLC患者標(biāo)本，另以264例健康體檢者作為正常對照組。本研究通過醫(yī)院倫理委員會討論通過。兩組資料在年齡、性別方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但病例組吸煙人數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 NSCLC患者和正常對照的一般資料Tab.1 Information of patients with NSCLC and normal control n (%)

1.2 DNA收集及分型檢測 每個患者提供治療前外周血1 mL，用含有EDTA抗凝劑的真空管收集后放-80 ℃保存待用。Wizard?基因組DNA純化試劑盒（美國Promega公司）用于分離DNA，提取過程按試劑盒說明操作。單核苷酸多態(tài)性檢測采用Taqman探針基因分型技術(shù)，在ABI 7500適時定量PCR擴(kuò)增儀上完成（AApp---plied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA）。探針、引物和Taqman通用PCR混合液均購于美國ABI公司。PCR總反應(yīng)體系為5 mL，混合有0.25 mL的引物和探針，2.5 mL PCR 反應(yīng)液和5 ng DNA。PCR反應(yīng)條件如下： 95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。每塊板上加有2個無DNA空白標(biāo)本，6個已知基因組DNA標(biāo)本，2個隨機(jī)重復(fù)的標(biāo)本分別作為陰性對照，陽性對照和質(zhì)量控制。7500擴(kuò)增儀附帶的隨機(jī)軟件SDS等位基因分型軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計處理 不同人群中的基因型之間以及2種基因型之間的療效對比均采用χ2檢驗(yàn)，再以結(jié)局為應(yīng)變量，基因型為自變量做非條件Logistic回歸，以比值比（OR）及其95%可信區(qū)間表示2種基因型多態(tài)性與療效的相關(guān)性。SPSS 11.0統(tǒng)計軟件用于統(tǒng)計分析，并計算OR值及95%可信區(qū)間，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

ATM 單核苷酸多態(tài)性（IVS62+60G＞A）基因型分布在NSCLC病例組和正常對照組中有差異。在NSCLC病例組中，A/A基因型占32.6%，A/G基因型占52.6%，G/G基因型占14.8%。而正常對照組中相應(yīng)的數(shù)值分別為26.0%、53.0%和21.0%。G/G基因型在NSCLC中所占的比例低于在正常人中的比例。Logistic回歸分析顯示攜帶有G/G基因型者肺癌發(fā)生的風(fēng)險明顯低于攜帶有A/A基因型者，危險系數(shù)是其的0.561倍（95%CI為0.334～0.942，P=0.029）；當(dāng)排除混雜因素，如性別、年齡和吸煙狀況等因素的干擾后，結(jié)果仍然有統(tǒng)計學(xué)意義，OR為0.569（95%CI為0.327～0.990，P=0.046，表2）。本研究中將ATM基因型吸煙和不吸煙患者及對照人群進(jìn)行分層分析（表3），未發(fā)現(xiàn)ATM基因分組在吸煙情況中有統(tǒng)計學(xué)差異（Pearson χ2=7.27，P=0.269）。

表2 NSCLC患者和正常對照組ATM基因型的分布情況Tab.2 The ATM gene distribution in patients with NSCLC and control

表3 ATM基因型吸煙和不吸煙患者及對照人群中的分布情況Tab.3 Comparison of ATM gene distribution in control and patients about smoking status

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)A T M單核苷酸多態(tài)性（IVS62+60G＞A）基因型分布在NSCLC病例組和正常對照組中有差異。G/G基因型在NSCLC中所占的比例低于在正常人中的比例，攜帶有G/G基因型者肺癌發(fā)生的風(fēng)險明顯低于攜帶有A/A基因型者，H值比是0.561，G等位基因的純合狀態(tài)可能是NSCLC發(fā)生的保護(hù)性因素。該結(jié)果與Kim等［6］的結(jié)論相同。該研究同時檢測了616對肺癌和健康人外周血中ATM基因多態(tài)性位點(diǎn)-518A＞G， IVS21-77C＞T，IVS61-55T＞C和IVS62+60G＞A，分析了它們與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果顯示只有IVS62+60G＞A與肺癌有相關(guān)性，其A位點(diǎn)基因較G位點(diǎn)基因患肺癌的危險性更高［6］。

在真核細(xì)胞中，各種因素（如代謝產(chǎn)物，紫外線、電離輻射等）會損傷細(xì)胞DNA。如果這些DNA損傷不能被修復(fù)，將導(dǎo)致基因的變異、染色體的缺失，影響細(xì)胞遺傳信息的精確傳遞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。作為損傷識別因子，ATM主要檢測電離輻射或紫外線導(dǎo)致的DNA損傷，從而被激活，并啟動細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)的各種信號通路。各種基因通過使各種蛋白磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡，如p53，mdm2和chk2基因，通過激活BRCA1，RAD50和NBS1等DNA修復(fù)基因啟動修復(fù)通路［7-10］。ATM基因功能異常將影響DNA損傷修復(fù)通路，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在該研究中ATM單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（rs664143，IVS62+60G＞A）位于ATM基因第62個外顯子的第60位核苷酸，生物信息學(xué)分析顯示其可能位于蛋白結(jié)合區(qū)，其變異可能影響基因的剪切，導(dǎo)致不同剪切物的形成。基因型為ATM60G/G可能影響了ATM蛋白的表型，與基因型為A/A的個體相比，有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力，是發(fā)生NSCLC的保護(hù)性因素。今后，我們將進(jìn)一步研究該位點(diǎn)的功能，為更好地闡述SNP在腫瘤易感性中所扮演的角色提供理論依據(jù)。

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