石 嶺，洪 皓，張 雁，劉 廷 強，魚 紅 閃，金 鳳 燮

（大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引言

丹參（SalviamiltiorrhizaBge.）是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，中藥丹參是植物丹參的干燥根及根莖［1］。

丹參中的主要有效成分為脂溶性丹參酮類和水溶性丹酚酸類［2］。脂溶性丹參酮類主要包括丹參酮ⅡA、丹參酮I、隱丹參酮、次甲丹參醌等；水溶性丹酚酸類主要以丹酚酸B 為主，還包括丹酚酸A、C、D、E、F、G、原兒茶醛、原兒茶酸等［3-4］。丹參酮ⅡA 是丹參中脂溶性活性成分的代表物質(zhì)，常作為評價丹參藥材質(zhì)量的重要指標。丹參酮ⅡA 藥理活性主要有天然抗氧化作用、心血管藥理作用、抗感染作用、抗腫瘤作用、對神經(jīng)細胞保護作用、性激素樣活性，對肝、腎、肺的保護作用，增強機體免疫功能、鎮(zhèn)痛、抗衰老等作用［5］。

我國丹參中成藥制備通常采用丹參和三七混合水浸，其水溶性浸出物和其他藥物混合制成丹參中成藥。但是水浸丹參和三七的藥渣中還含有丹參脂溶性成分——丹參酮等，為了充分利用丹參藥渣中的脂溶性成分——丹參酮，本文主要研究了從水浸丹參后藥渣中分離純化丹參酮ⅡA，為其工業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

丹參酮ⅡA、次甲丹參醌、隱丹參酮標準品，大連工業(yè)大學朱靖博教授提供，純度在95%以上；硅膠，青島海洋化工廠生產(chǎn)；薄層層析板Silica Gel 60-F254，德國Merck公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 丹參藥渣中丹參酮的提取

丹參和三七水浸后的濕藥渣經(jīng)干燥、乙醇提取、濃縮干燥得到丹參藥渣乙醇提取物；丹參藥渣乙醇提取物，用7倍體積的乙醚提取3次，每次浸泡2d，合并提取液、減壓濃縮、干燥，得到丹參酮復合物。

1.2.2 硅膠柱層析分離

樣品膠的制備：稱取乙醚提取的丹參酮復合物加入適量80～100目的硅膠，放入瓷碗中并倒入乙酸乙酯，攪拌使固體充分溶解，置于50 ℃水浴鍋上加熱，待溶劑揮發(fā)后即成樣品膠。

裝硅膠柱：在底部塞有脫脂棉的硅膠柱里裝入300～400目的硅膠作為分離膠，保持上表面水平，抽真空使之細密均勻，在其上加入一層4cm高的80～100目的硅膠，起到緩沖作用，然后再裝入干燥好的樣品膠并在其表面鋪上脫脂棉層。

梯度洗脫：柱裝好后，首先用純石油醚通柱，柱子打通后，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10為流動相進行梯度洗脫。此過程由薄層層析檢測監(jiān)控，調(diào)整洗脫液中石油醚與乙酸乙酯的比例，每瓶收集150mL，根據(jù)薄層層析檢測結(jié)果收集洗脫液。

1.2.3 分析方法

分析樣品的制備：稱取丹參酮標準品1 mg，溶于1mL的色譜甲醇中；樣品丹參酮1mg，溶于1mL的色譜甲醇中。

薄層層析法：在薄層層析板上，用毛細管吸取標準品及樣品，點樣于薄層層析板上，每次點樣依照樣品濃度確定點樣次數(shù)，每次點樣均須用電吹風吹干。丹參酮展開劑：V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）=8∶3∶1，直接觀察。

高效液相色譜法：高效液相色譜儀，美國Waters 2695-2996DAD；色譜柱，Hypersil ODS2（5μm，150mm×4.6mm）；進樣量，10μL；體積流量，1.0 mL/min。流動相A 為水，B 為甲醇。流動相比例如表1所示。

表1 HPLC檢測的流動相條件Tab.1 Condition of mobile phase for HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 丹參藥渣中丹參酮的提取

稱取丹參藥渣乙醇提取物500g，用7倍體積的乙醚提取3次，每次浸泡2d，合并提取液、減壓濃縮、干燥，得到丹參酮復合物146g，得率為29.2%。

為檢測丹參藥渣乙醇提取物中丹參酮提取情況及丹參酮是否提取完全，取少量乙醚提取3次后的殘渣，用乙醚溶解，進行TLC檢測，如圖2所示。

圖2 丹參藥渣中丹參酮的提取Fig.2 Extraction of tanshinone in the dregs

由圖2可看出，乙醚提取的丹參酮復合物，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）=8∶3∶1 作為展開劑，丹參酮展開距離較好，作為TLC法檢測丹參酮的展開劑較為理想；丹參藥渣乙醇提取物經(jīng)乙醚提取3次，丹參酮基本提取完全。從圖2也可看出，乙醚提取的丹參酮復合物中丹參酮ⅡA 含量較高，適合丹參酮ⅡA 的分離純化。

2.2 丹參酮ⅡA 分離純化

丹參酮ⅡA 的分離純化，用硅膠柱層析法進行，稱取12g乙醚提取的丹參酮復合物加入80～100目的硅膠30g，放入瓷碗中并倒入乙酸乙酯，攪拌使固體充分溶解，置于50 ℃水浴鍋上加熱，待溶劑揮發(fā)后即成樣品膠。然后在底部塞有脫脂棉的硅膠柱里裝入300～400目的硅膠200g作為分離膠，保持上表面水平，抽真空使之細密均勻，在其上加入一層4cm 高的80～100目的硅膠作為緩沖層，再裝入干燥好的樣品膠并其表面鋪上脫脂棉層。純石油醚通柱，柱子打通后，以V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10為流動相進行梯度洗脫，每瓶收集150mL，對收集液進行TLC檢測，部分TLC檢測結(jié)果，如圖3所示。

圖3 硅膠柱分離丹參酮復合物的TLC 部分檢測圖Fig.3 Tanshinone separated by silica gel column on TLC

根據(jù)圖3薄層層析檢測結(jié)果可知，1～20瓶丹參酮ⅡA 沒有被洗出，21～26瓶主要含有丹參酮ⅡA，在27 瓶已含有次甲丹參醌，丹參酮ⅡA的分離比較成功，表明硅膠柱可用于丹參酮ⅡA的分離純化；對21～26瓶收集液進行低壓濃縮、結(jié)晶、抽濾、干燥，首次得到丹參酮ⅡA 晶體0.08g，得率為0.67%，再次結(jié)晶得到0.03g不純的丹參酮ⅡA。

2.3 丹參酮ⅡA 結(jié)晶純度檢測

上述丹參酮ⅡA 結(jié)晶純度采用高效液相色譜法檢測。稱取1mg首次結(jié)晶得到的丹參酮ⅡA，溶于1 mL 色譜甲醇，進樣10 μL，體積流量1.0mL/min，檢測波長270nm。檢測結(jié)果，如圖4所示，丹參酮ⅡA 的出峰時間為24.329min，檢測出丹參酮ⅡA 純度為96%。

圖4 高效液相色譜法檢測丹參酮ⅡA 純度Fig.4 Examination tanshinoneⅡA on HPLC

3 結(jié)論

丹參藥渣乙醇提取物利用乙醚溶液提取3次，丹參酮基本提取完全，丹參酮復合物從丹參藥渣乙醇提取物的得率為29.2%。應(yīng)用硅膠柱層析法制備丹參酮ⅡA，用V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=99∶1～90∶10進行梯度洗脫，純品丹參酮ⅡA 得率為0.67%，純度達到96%。為利用丹參藥渣工業(yè)化制備丹參酮ⅡA 奠定了基礎(chǔ)。