張 熹，祖 國 仁，陳 莉，劉 陽

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

生物活性多糖因其具有調(diào)節(jié)人體生理功能與增強免疫力的作用，而成為當(dāng)前國內(nèi)外科學(xué)研究的熱點課題［1-3］。海洋微生物所處的高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境使其遺傳及生理特性與陸地微生物有所不同，賦予其獨特的生化結(jié)構(gòu)和生存機制，是開發(fā)新型多糖類免疫調(diào)節(jié)劑的重要資源［4］。海洋微生物胞外多糖是海洋微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的多糖或多糖復(fù)合物，以適應(yīng)其生存環(huán)境，維持生命活動。這類多糖大多是由多種單糖按照一定比例組成的雜多糖，其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最為常見；另外還含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等［5］。海洋微生物胞外多糖具有抗腫瘤、增強免疫、清除自由基和抗氧化等活性［6］。本文主要對1株海洋細菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

海洋細菌B1109，從大連金石灘涼水灣海區(qū)潮間帶海泥中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏1 g/L，蒸餾水400 mL/L，陳海水600mL/L。

種子培養(yǎng)基：同發(fā)酵培養(yǎng)基。

試管斜面培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基加入瓊脂20g/L。

1.1.3 儀 器

ZHWY-2102C空氣恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-SG46-280SA 手提式高壓消毒器，上海市醫(yī)療儀器廠；TGL-16G 高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；722 型分光光度計，上海分析儀器廠；ZPS-250智能生化培養(yǎng)箱，黑龍江東拓儀器制造有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 測定方法

生物量測定：取定量的菌體培養(yǎng)液，稀釋一定的倍數(shù)后，用722分光光度計在600nm 下測定OD 值，以空白培養(yǎng)基作為對照。

多糖的測定：取定量發(fā)酵液于3 000r/min離心20 min，取上清液，加3 倍95%乙醇沉降，4 ℃冰箱內(nèi)保存。再次離心后將沉淀溶于水，加1倍氯仿正丁醇混合溶液離心去蛋白，取上清液，加3倍95%乙醇，冰箱沉降。將沉淀溶于一定量的水，苯酚-硫酸法測定胞外多糖［7］。

1.2.2 培養(yǎng)條件

海洋細菌B1109菌株活化。取1～2環(huán)海洋細菌B1109接入種子培養(yǎng)基，28 ℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)24h。將其取一定量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL的三角瓶中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)一定時間，按方法“1.2.1”測定碳源、氮源及不同培養(yǎng)條件對海洋細菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響，并以培養(yǎng)基裝量、溫度、接種量和培養(yǎng)基初始pH 培養(yǎng)條件為實驗因素，設(shè)計3 個水平，進行L9（34）正交試驗，綜合考察培養(yǎng)條件對產(chǎn)胞外多糖的影響，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The table of orthogonal experiment factor horizontal

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

選取培養(yǎng)基裝量300 mL/L 三角瓶，種子接入量2%（相對培養(yǎng)基裝量），培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)基初始pH 自然。改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、牛肉膏和甘露醇），按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 Effect of carbon sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳源是菌株生長過程中為菌株提高碳素來源的物質(zhì)，菌株的生長及多糖的積累均受碳源的種類和加入量的影響。菌株利用碳源是具有選擇性的，糖類一般是良好的碳源和能源物質(zhì)，但菌株對不同糖類物質(zhì)的利用也有差別。從圖1可見，以麥芽糖、葡萄糖甚至蔗糖作為碳源，海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖都相對較高，考慮工業(yè)葡萄糖來源廣泛且價格便宜，本研究以葡萄糖作為產(chǎn)糖的碳源。

2.2 氮源對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，以葡萄糖為碳源，改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（蛋白胨、玉米漿、干酪素、硫酸銨、氯化銨和硝酸鈉），按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，結(jié)果見圖2。

圖2 氮源對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

氮源是菌株生長另一個重要元素，氮源的有無，菌株利用的好壞直接影響菌株的生長，從而影響菌株對多糖的積累。從圖2可見，以硫酸銨為氮源，海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果最好。

2.3 碳、氮質(zhì)量濃度對海洋細菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，以葡萄糖、硫酸銨為碳源和氮源，選取發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 和60g/L，按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，再以確定的最佳碳源質(zhì)量濃度，選取氮源質(zhì)量濃度分別為2、3、4、5、6和7g/L進行實驗，結(jié)果見圖3、4。

圖3 碳源質(zhì)量濃度對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effect of carbon content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

圖4 氮源質(zhì)量濃度對海洋細菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effect of nitrogen content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳、氮是微生物菌株生長不可缺少的2種元素，同時二者在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度也直接影響著菌株的生長與代謝產(chǎn)物的合成。質(zhì)量濃度過低則不能滿足菌株生長的需要，質(zhì)量濃度過高也會抑制菌株的生長。只有在較適合濃度時，才能促進菌株的生長，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。從圖3 和圖4可見，葡萄糖質(zhì)量濃度為20g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度為4g/L時，海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果最好。

2.4 培養(yǎng)條件對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH 對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

選取發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源為葡萄糖和硫酸銨，質(zhì)量濃度分別為20和4g/L，培養(yǎng)條件同上，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)基初始pH 對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effect of culture medium initial pH on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同微生物菌株其生長及代謝產(chǎn)物積累的pH 要求是不同的，從圖5可見，海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖較佳pH 7.0～8.0，中性偏堿性，以培養(yǎng)基初始pH 8.0為最佳。

2.4.2 培養(yǎng)基裝量對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

培養(yǎng)條件同上，確定培養(yǎng)基初始pH 為8.0，分別在100 mL 三角瓶中裝入20、30、40、50、60和70mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)基裝量對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.6 Effect of culture medium volume on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在確定的搖床轉(zhuǎn)數(shù)下，培養(yǎng)基裝量多少實際反映的是微生物菌株對氧的需求。從圖6可見，在100 mL 的三角瓶中，培養(yǎng)基裝量為30～40mL，海洋細菌B1109產(chǎn)糖較高，以裝量40mL時產(chǎn)糖最高。

2.4.3 接種量對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，確定培養(yǎng)基裝量40mL，選取種子接入量分別為2%、4%、6%、8%、10%和12%，按實驗方法“1.2.2”進行實驗，測定胞外多糖，結(jié)果如圖7所示。

圖7 接種量對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.7 Effect of inoculation quantity on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在定量基質(zhì)培養(yǎng)基中，種子接入量過少，在一定時間菌株生長達不到一定數(shù)量；種子接入量過多，菌體濃度過密，也影響其生長，最終結(jié)果都會影響胞外多糖的產(chǎn)生。從圖7可見，6%的種子接入量，海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果較好。

2.4.4 培養(yǎng)溫度對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)培養(yǎng)條件，確定種子接入量6%，分別在22、24、26、28、30和32℃條件下培養(yǎng)海洋細菌產(chǎn)胞外多糖，測其產(chǎn)糖量，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.8 Effect of temperature on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同的微生物菌株有不同的適合生長溫度，一般海洋微生物更適合較低的溫度，從圖8可見，隨著溫度升高，海洋細菌B1109 產(chǎn)糖量逐漸增大，26 ℃產(chǎn)糖達到高峰，28 ℃以上開始下降。

2.4.5 培養(yǎng)條件的正交試驗

以培養(yǎng)條件單因素試驗為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基裝量、溫度、接種量和培養(yǎng)基初始pH 培養(yǎng)條件為試驗因素，設(shè)計3個水平，進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗因素水平結(jié)果Tab.2 The result of orthogonal experiment factor horizontal

從表2的R值大小可知，各因素影響主次順序為：B＞C＞A＞D，即培養(yǎng)溫度＞接種量＞培養(yǎng)基裝量＞培養(yǎng)基初始pH；產(chǎn)胞外多糖最優(yōu)水平組合為：A2B1C2D2，即培養(yǎng)溫度24 ℃，接種量6%，培養(yǎng)基裝量400mL/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0。從實驗結(jié)果可見，在確定的營養(yǎng)成分碳源、氮源條件下，影響海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖的首要因素是培養(yǎng)溫度。海洋微生物長期生長在一個較低的溫度環(huán)境，其生長和產(chǎn)生胞外多糖對溫度的要求較高，這符合海洋微生物的特性；其次是接種量，培養(yǎng)基裝量和培養(yǎng)基初始pH 影響不大。

2.5 海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖動力曲線

以上述確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)海洋細菌B1109，選取培養(yǎng)時間為24、48、72、96、120、144和168h，測定產(chǎn)胞外多糖和生長情況，結(jié)果見圖9。

圖9 海洋細菌B1109生長和產(chǎn)胞外多糖Fig.9 Growth and producing exopolysaccharides of marine bacterium B1109

由圖9可見，海洋細菌B1109從24h后就開始進入快速生長期，96h達到生長高峰，之后進入穩(wěn)定期。胞外多糖的產(chǎn)生的高峰時間是在120h，即在菌株生長進入穩(wěn)定期之后，最高產(chǎn)糖為4.29g/L。

3 結(jié)論

海洋細菌B1109產(chǎn)胞外多糖最適碳源、氮源分別為葡萄糖和硫酸銨。質(zhì)量濃度分別為20和4g/L。其培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，硫酸銨4g/L，酵母膏1g/L，蒸餾水400 mL/L，陳海水600mL/L，pH 8.0。

海洋細菌B1109 產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)條件為：100mL三角瓶裝量40 mL，接種量6%，24 ℃，200r/min

搖床培養(yǎng)120h。在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量4.29g/L。

海洋細菌B1109培養(yǎng)24～96h為快速生長期，96h以后進入穩(wěn)定期。產(chǎn)胞外多糖高峰時期在穩(wěn)定期120h。