翟 秋 梅，薛 衛(wèi) 巍，薛 永 常，鄭 來 久

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 紡織輕工學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

近年來，果膠酶由于在食品加工、飼料加工、紡織、造紙、環(huán)境保護(hù)、誘導(dǎo)植物抗病等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用［1］而備受關(guān)注，果膠酶生產(chǎn)優(yōu)化則是降低成本和提高生產(chǎn)效率的基礎(chǔ)。果膠酶生產(chǎn)中良好的碳源既能夠促進(jìn)菌種生長又能夠作為誘導(dǎo)物促進(jìn)產(chǎn)酶，因此碳源的選擇在產(chǎn)酶發(fā)酵中作用突出。張保國、李祖明等［2-3］將甜菜渣作為最適碳源與誘導(dǎo)物提高了產(chǎn)酶效率，蘭穎輝等［4］利用橘皮粉作為碳源進(jìn)行果膠酶產(chǎn)酶發(fā)酵也大大提高了產(chǎn)酶效率。本實驗室從青海柴達(dá)木盆地漚制的羅布麻表皮中篩選到1株高效產(chǎn)果膠酶的菌株——枯草芽孢桿菌（BacillussubtilisFM208849），并將其應(yīng)用于羅布麻的微生物脫膠，取得了良好的脫膠效果［5-6］。本實驗立足碳源作用的本質(zhì)，除了對氮源與無機鹽進(jìn)行優(yōu)化外，還從碳源（菌種生長）和誘導(dǎo)物（誘導(dǎo)產(chǎn)酶）的比例上對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到好的產(chǎn)酶效果；同時對產(chǎn)酶發(fā)酵液的果膠酶進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌 種

枯草芽孢桿菌（BacillussubtilisFM208849）由遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室與紡織工程重點實驗室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌20min。

1.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.1 菌種生長優(yōu)化

1.3.1.1 碳源優(yōu)化

分別用10g/L 的葡萄糖、淀粉、玉米淀粉和果膠等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖制備培養(yǎng)基。接種搖瓶培養(yǎng)若干小時，以不接種的培養(yǎng)基為空白對照，在600nm 下測OD值［7］以確定最佳碳源。

1.3.1.2 氮源優(yōu)化

分別用10g/L的酵母浸出物、牛肉膏、尿素、硫酸銨、酵母浸出物+蛋白胨（質(zhì)量比1∶1）、酵母浸出物+蛋白胨+硫酸銨（質(zhì)量比2∶2∶1）及酵母浸出物+蛋白胨+尿素（質(zhì)量比2∶2∶1）替代基礎(chǔ)發(fā)酵液中10g/L 的蛋白胨。接種搖瓶培養(yǎng)若干小時，以不接種的培養(yǎng)基為空白對照，在600nm 下測OD 值以確定最佳氮源。

1.3.1.3 無機鹽優(yōu)化

分別用4g/L 的硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鈉等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵液中的磷酸二氫鈉（2g/L）+磷酸氫二鈉（2g/L），以不加無機鹽的為空白。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)若干小時后測定發(fā)酵液的OD600值，以確定最佳無機鹽。

1.3.1.4 C/N 優(yōu)化

確定了培養(yǎng)基的最佳碳源和氮源后，進(jìn)行碳氮比實驗，碳源與氮源的質(zhì)量比分別為：1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，培養(yǎng)若干小時后，以不接種的培養(yǎng)基為空白對照測定OD600值。

1.3.1.5 正交試驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取碳源質(zhì)量濃度、氯化鈉質(zhì)量濃度及初始pH 值3個重要因素，選用3因素3水平L9（33）正交表進(jìn)行實驗，結(jié)果見表1。

1.3.2 產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的優(yōu)化

果膠既是誘導(dǎo)物又是碳源［8-10］，因此本實驗從碳源果膠含量的角度上對產(chǎn)酶誘導(dǎo)物進(jìn)行優(yōu)化。在得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，葡萄糖與果膠的質(zhì)量比按1∶3、2∶2、3∶1的比例分別進(jìn)行實驗，發(fā)酵24、48、72、96h，發(fā)酵后的粗酶液進(jìn)行酶活測定［11-12］，得出葡萄糖與果膠最佳配比和最佳發(fā)酵時間。

表1 正交試驗條件表Tab.1 Orthogonal experimental conditions

1.4 果膠酶初步分析

1.4.1 果膠酶最適pH 的測定

酶解反應(yīng)分別在pH 為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5的緩沖液中進(jìn)行，溫度取45 ℃，測酶活，以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線以確定最適pH。

1.4.2 果膠酶最適溫度的測定

酶解反應(yīng)分別在35、40、45、50、55℃下進(jìn)行，pH 取9.5，測酶活，以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線。

1.4.3 果膠酶的丙酮分級沉淀

利用0～16.7%、16.7%～28.6%、28.6%～37.5%、37.5%～44.4%、44.4%～50%、50%～54.5%、54.5%～58.3%、58.3%～61.5%、61.5%～64.3%、64.3%～66.7%的丙酮濃度梯度對粗酶液進(jìn)行分級沉淀。

1.4.4 SDS-PAGE

利用SDS-PAGE 方法［3］測果膠酶的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源優(yōu)化

培養(yǎng)基中加入了不同碳源后，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)10.5h后，測其OD600nm值，所得數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 碳源種類對菌體生長的影響Tab.2 Effect of different carbon sources on the growth of strain

在其他條件相同的情況下，以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的菌體生長最快，其次是淀粉和蔗糖。但以果膠和玉米淀粉作碳源的培養(yǎng)基，菌體生長速率明顯下降，說明該枯草芽孢桿菌對單糖的利用能力高于淀粉、果膠等多糖，對可溶性淀粉的利用能力高于玉米淀粉。

2.2 氮源優(yōu)化

培養(yǎng)基加入了不同氮源后，經(jīng)搖瓶10.5h，測其OD600值，所得數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 氮源種類對菌體生長的影響Tab.3 Effect of different nitrogen sources on the growth of strain

結(jié)果表明，由牛肉膏作為氮源的培養(yǎng)基OD600值明顯高于其他氮源，而且無機氮源硫酸銨并不利于其生長。說明牛肉膏作為一種有機氮源含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，足夠滿足菌體的生長，因而菌體增殖最快，選取牛肉膏為最佳氮源。

2.3 無機鹽優(yōu)化

培養(yǎng)基中加入了不同無機鹽后，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)10.5h后，測其OD600值，所得數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 無機鹽對菌體生長的影響Tab.4 Effect of different inorganic minerals on the growth of strain

由表4可見，培養(yǎng)基中加入無機鹽會促進(jìn)菌體的生長，其中適量氯化鈉對提高菌體的生長速率作用更為明顯，但硫酸錳和硫酸鐵會抑制菌體的生長。因此，在培養(yǎng)基中應(yīng)加入適量氯化鈉，以提高菌體的生長速率。

2.4 碳氮比實驗

不同碳氮比的培養(yǎng)基經(jīng)接種搖瓶培養(yǎng)7h后，測其OD600值，結(jié)果如表5所示。由表5可見，碳氮比1∶1 為最佳比例。正交試驗中沒有將C/N設(shè)為因素考慮。

表5 碳氮比對菌體生長的影響Tab.5 Effect of different carbon-nitrogen ratio on the growth of strain

2.5 正交試驗

將碳源質(zhì)量濃度、氯化鈉質(zhì)量濃度及初始pH 值3個因素進(jìn)行L9（33）的正交試驗，結(jié)果如表6所示。其中最優(yōu)實驗為第1次實驗，即碳源與氮源的質(zhì)量濃度分別為5g/L、氯化鈉的質(zhì)量濃度為2g/L、初始pH 7.0。

表6 L9（33）正交試驗表Tab.6 L9（33）orthogonal experiment

由表7方差分析可知，三因素中氯化鈉質(zhì)量濃度和初始pH 對菌體生長影響顯著。根據(jù)實驗結(jié)果確定的最佳方案為A3B1C2，即枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖與牛肉膏分別為5g/L、氯化鈉2g/L，初始pH 8.0。

表7 正交試驗方差分析Tab.7 Analysis of variance of orthogonal experiment

為了進(jìn)一步驗證所推論的最佳方案，實驗又對最佳方案和正交試驗中的最優(yōu)方案進(jìn)行了對比驗證實驗，結(jié)果如表8所示。表明預(yù)測最佳方案所測得OD600值高于正交試驗中的最優(yōu)試驗，說明預(yù)測的結(jié)果最佳。為下一步誘導(dǎo)物優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

表8 正交試驗驗證表Tab.8 Verification of orthogonal experiment

2.6 誘導(dǎo)物優(yōu)化

不同碳源配比、不同發(fā)酵時間下所測的酶活如表9所示。

表9 果膠與葡萄糖配比對菌體生長的影響Tab.9 Effect of different pectin-glucose ratio on the growth of strain

當(dāng)m（果膠）∶m（葡萄糖）=1∶3時，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在24h左右，而其他比例條件下的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)時間較長，因此m（果膠）∶m（葡萄糖）=1∶3時菌種能夠在較短時間內(nèi)大量產(chǎn)酶，最佳比例的確定不僅能夠利于工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源的選擇，而且就麻類生物脫膠而言，可根據(jù)麻類韌皮中含有的糖類比例選擇麻收割的時間和麻的品種，從而有利于生物脫膠的高效進(jìn)行。

2.7 果膠酶最適pH 的測定

酶解反應(yīng)分別在pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下進(jìn)行15min后測酶活，以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線如圖1 所示，最適pH 為9.5。

圖1 pH 對酶活的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of the crude pectinase

2.8 果膠酶最適溫度的測定

酶解反應(yīng)分別在溫度為35、40、45、50、55 ℃下進(jìn)行15min后測酶活，以最高酶活為100%繪制相對酶活曲線如圖2所示，最適溫度為40 ℃。

圖2 溫度對酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of the crude pectinase

2.9 丙酮分級沉淀

對發(fā)酵液進(jìn)行丙酮分級沉淀并測酶活，選擇丙酮濃度梯度分別為0～16.7%、16.7%～28.6%、28.6%～37.5%、37.5%～44.4%、44.4%～50%、50%～54.5%、54.5%～58.3%、58.3%～61.5%、61.5%～64.3%、64.3%～66.7%。果膠酶在不同梯度丙酮溶液中的分布結(jié)果如表10所示。

表10 不同丙酮梯度下的果膠酶活性Tab.10 Activity of crude pectinase on different acetone gradient

由表10可見，果膠酶在28.6%～37.5%的丙酮濃度梯度酶活最高，在44.4%～50%、61.5%～64.3%丙酮濃度梯度下酶活較低，因此實驗選擇28.6%～37.5%（2 泳道）、44.4%～50%（1泳道）、61.5%～64.3%（3泳道）3個丙酮濃度梯度等級進(jìn)行電泳，如圖3所示。2泳道有1條明顯的帶，且1、3泳道也有但濃度低于2泳道，與酶活測定結(jié)果相符。利用軟件bandscan測出坐標(biāo)進(jìn)而初步計算出該果膠酶的分子質(zhì)量在39.3ku左右。

圖3 不同丙酮梯度下SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Electrophoretogram SDS-PAGE on different acetone gradient

3 結(jié)論

（1）從菌種生長和誘導(dǎo)物兩個方面對Bacillus subtilisFM208849產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基為：果膠與葡萄糖共4g/L（質(zhì)量比為1∶3），牛肉膏15g/L，NaCl 2g/L，培養(yǎng)時間為24h。

（2）果膠與葡萄糖的比例大大影響了酶的產(chǎn)量和產(chǎn)酶速率。葡萄糖作為本脫膠菌種最佳碳源，既能促進(jìn)菌種生長，但同時也能抑制果膠的利用，從而抑制果膠酶的產(chǎn)生。因此果膠與葡萄糖的比例對果膠酶生產(chǎn)而言非常重要。

（3）通過實驗測得本實驗用脫膠菌種所產(chǎn)果膠酶最適反應(yīng)pH 為9.5，最適反應(yīng)溫度為40℃，并通過丙酮分級沉淀和SDS-PAGE 初步測得該果膠酶的分子質(zhì)量在39.3ku左右。