鄒險峰,陳 星,高長城

(長春大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品深加工吉林省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130022)

一種測定大豆蛋白質(zhì)水解度的簡易方法

鄒險峰,陳 星,高長城

(長春大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品深加工吉林省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130022)

介紹了一種新的測定大豆蛋白質(zhì)水解度的方法,G-25色譜層析法。該方法利用快速蛋白純化系統(tǒng)將大豆蛋白水解多肽溶液進(jìn)行 G-25色譜層析,根據(jù)蛋白峰和肽峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)的水解度,并與甲醛滴定法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,G-25色譜層析法測定的大豆蛋白水解度略低于甲醛滴定法。該方法快速、簡便,可以普遍適用于各種蛋白質(zhì)水解度的測定。

大豆蛋白質(zhì);水解度;G-25色譜層析

大豆蛋白質(zhì)是目前最重要的植物蛋白源,含有人體需要的全部 8種必需氨基酸,且比例合理,氨基酸含量與動物蛋白相似,特別是賴氨酸含量可達(dá)到動物蛋白水平。但是,大豆蛋白質(zhì)分子量大,溶解度低,含有腹脹因子、胰蛋白酶抑制劑、血球凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子,易受溫度、酸堿度等理化因素影響,且有一定的抗原性,消化率和生物利用率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及雞蛋和牛奶等動物蛋白質(zhì)。大豆多肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解而成的多種低分子量多肽混合物,通常由 3～6個氨基酸組成,其分子量主要分布在 1 000 Da左右。大豆多肽具有與大豆蛋白質(zhì)相同的氨基酸組成,消除了對人體有害的各種抗?fàn)I養(yǎng)因子,抗原性更低,溶解性極佳,易吸收,還具有提高免疫力、抗疲勞、降低膽固醇等多種生理功能。因此,大豆多肽正在被廣泛研究并應(yīng)用。在實(shí)際生產(chǎn)過程中,采用水解度(Degree of Hydrlysis,DH)來反映大豆蛋白質(zhì)的水解程度,作為重要的產(chǎn)品質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)。水解度通常定義為：DH=h/htot×100%式中 h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù) (m·mol/ g),htot為每克蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù) (m·mol/g)。htot對于特定的蛋白質(zhì)是常數(shù),如大豆蛋白質(zhì)其 htot=

7.8 mmol/g,因此通過測定被水解的肽鍵數(shù)即可計(jì)算出相應(yīng)的DH值。

常見的測定蛋白質(zhì)水解度的方法有茚三酮法、甲醛滴定法[1]、三硝基苯磺酸法 (TNBS)[2]、pH-STAT[3]等方法。國外通常采用 pH-STAT法,但該方法需要特殊儀器。國內(nèi)通常采用甲醛滴定法和茚三酮法。茚三酮法采用單一氨基酸做標(biāo)準(zhǔn),而不同的氨基酸對茚三酮的顯色有偏差,而且比色時讀數(shù)不穩(wěn)定,結(jié)果不夠準(zhǔn)確。甲醛滴定法操作相對簡單,但測定值偏低。TNBS法測定結(jié)果較準(zhǔn)確,但分析方法繁雜,所用試劑不易獲得。本文介紹一種新的測定蛋白質(zhì)水解度的方法,利用快速蛋白純化系統(tǒng)將大豆蛋白水解多肽溶液進(jìn)行 G-25色譜層析,根據(jù)蛋白峰和肽峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)的水解度。與甲醛滴定法比較,該方法更為簡便易用,水解度值略低,可以普遍適用于各種蛋白質(zhì)水解度的測定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大豆分離蛋白(吉林省通榆蛋白質(zhì)廠),大豆蛋白改性酶(南寧龐博生物工程有限公司),堿性蛋白酶 、中性蛋白酶 (無錫酶制劑廠),風(fēng)味蛋白酶(丹麥諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司),其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

主要試劑：(1)甲醛溶液 (預(yù)先調(diào)到中性),(2)標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液(0.1 moL/L),(3)酚酞溶液(1%)。

1.2 主要儀器和設(shè)備

蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng)AKTA EXPLORER 100型(美國 GE公司),Sephadex G-25 Medium凝膠 (美國 GE公司),冷凍干燥儀 FDU-2100型(日本 EYELA公司),精密酸度計(jì) pHS-2型(上海雷磁儀器廠),高速冷凍離心機(jī) J-26XP(美國BECK MAN COULTER公司),恒溫水浴箱DK-98型(天津泰斯特儀器公司),磁力攪拌器CJJ78-1型(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆多肽制備工藝路線及酶解條件

大豆分離蛋白→調(diào)漿→酶解→滅酶→酸沉離心分離→上清液冷凍干燥。

分別取大豆分離蛋白 1g,各加 100 mL蒸餾水,攪拌均勻,分別加入 10 000U/g的蛋白水解酶在適宜的溫度和 pH條件下水解 5h,90℃滅酶 10 min,加入三氯乙酸(TCA)調(diào) pH 3.5～4.0沉淀未水解蛋白,8 000 rpm/ min離心 15 min,取上清液凍干。

選擇了四種大豆蛋白水解酶,分別為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、大豆蛋白改性酶和風(fēng)味酶。各種蛋白酶在推薦的最適條件下水解,具體見表 1。

表1 蛋白酶的酶活力和酶解條件

1.3.2 總氮含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定方法采用 GB/T5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測定。

1.3.3 蛋白水解度的測定

采用甲醛滴定法[4]。分別取蛋白水解液 2.0 mL于 3個標(biāo)有號碼的 100 ml三角瓶中,加入 5 mL蒸餾水及 1%酚酞溶液 3滴,搖勻。用 0.1 moL/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定 3號瓶至微紅色,作為終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)并記下讀數(shù)V2,向第一和第二號瓶中分別加入 2 mL中性甲醛溶液,混勻,再用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至和 3號瓶溶液顏色相同為止,記下讀數(shù),求出平均值V1,按下式計(jì)算水解度。

1.3.4 G-25柱效的測定

以 1%柱體積的丙酮(濃度為 1%)上樣,記錄洗脫峰,根據(jù)下式計(jì)算柱效：

柱效(HETP)=柱床高度(L)/每米理論塔板數(shù) (N),

N=5.54(Ve/W1/2)2,

Ve=保留體積,W1/2=半峰高峰寬。

1.3.5 G-25層析法測定蛋白質(zhì)水解度

取柱效大于 8 000的 G-25層析柱(10×700 mm)與蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng)相連。以蒸餾水為流動相平衡5個柱體積,取蛋白水解液 2 mL上樣,啟動洗脫程序 (流速：1 mL/min,檢測波長：280 nm),記錄程序洗脫過程,按下式計(jì)算水解度。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醛滴定法測定大豆分離蛋白水解度

甲醛滴定法測得的大豆分離蛋白水解度見表 2,所有數(shù)據(jù)均為平行三次取平均值。

表2 甲醛滴定法測得的水解度

從表 2可以看出,選擇的四種蛋白水解酶均達(dá)到了較高的水解度,其中堿性蛋白酶的水解效果最好,堿性蛋白酶也是目前生產(chǎn)大豆蛋白水解肽的最常用酶。

2.2 G-25層析分離大豆分離蛋白水解液

G-25層析分離大豆分離蛋白水解液的洗脫圖譜見圖 1。

圖 1 大豆分離蛋白水解液的 G-25洗脫圖譜

從圖 1可以看出大豆分離蛋白的酶解液的 G-25色譜圖譜基本出現(xiàn) 2～3個峰。最快出現(xiàn)的峰 1為分子量最大的蛋白峰,盡管大豆分離蛋白為多種蛋白的混合物,后加入的蛋白水解酶也是大分子蛋白質(zhì),但由于 G-25凝膠的分離范圍為 1 000～5 000 Da,這些大分子蛋白質(zhì)并沒有被 G-25凝膠色譜分開,而是呈現(xiàn)一個尖峰。峰 2、峰 3大豆分離蛋白的不同酶解程度的多肽混合物峰,分子量不高于 103數(shù)量級,處于 G-25凝膠的分離范圍,但由于多肽混合物種類過多、分子量相差不大,呈現(xiàn)一個帶有肩峰的緩峰,只有風(fēng)味酶的多肽峰為兩個獨(dú)立的洗脫峰,可能是因?yàn)轱L(fēng)味酶為混合酶,存在二次酶解過程,即將酶解多肽再次水解成更小的寡肽甚至是氨基酸。層析采用的 G-25凝膠柱要求柱效在 8 000以上,是為了保證大豆分離蛋白與酶解多肽的完全分離。G-25層析分離大豆分離蛋白的洗脫峰面積結(jié)果見表 2。

表3 G-25層析結(jié)果和水解度

從表 2、表 3可以看出,G-25層析法較甲醛滴定法測得的大豆分離蛋白水解度值略低,可能是因?yàn)榱砑尤氲牡鞍酌冈黾恿说鞍追宓拿娣e,兩種方法的偏差在 0.5～1.3之間,兩組數(shù)據(jù)基本呈線性關(guān)系,G-25層析法完全可以滿足工業(yè)生產(chǎn)對蛋白水解度測定準(zhǔn)確度的要求。

3 結(jié) 論

G-25層析法是大豆分離蛋白水解度的直接測定方法,利用 G-25凝膠色譜對蛋白質(zhì)和多肽的分離來計(jì)算蛋白的水解度。本方法與傳統(tǒng)的甲醛滴定法相比,測定結(jié)果偏低,這是因?yàn)樵诿附怏w系中加入了水解酶蛋白。該方法操作簡單、快速,不僅可以提供蛋白的水解度,還提供了酶解多肽的更直觀的水解結(jié)果。但該方法需要蛋白質(zhì)快速純化系統(tǒng)的支持,與酶解多肽的進(jìn)一步純化研究相結(jié)合更為適用。

[1] 寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998：119-124.

[2] Adler-Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid[J].J Agric Food Chem, 1979,27(6)：1256-1262.

[3] Alder-Nissen J.Enzymatic Hydrolysis of Food Protein[M].London：ElsevierApplied Science Publishers,1986：12-14.

[4] 王歲樓,祝紅蕾,張棟.小麥蛋白酶解制備活性多肽的研究[J].食品科學(xué),2008,29(9)：388-392.

責(zé)任編輯：鐘 聲

A simple method of determ in ing the hydrolytic degree of soybean prote in

ZOU Xian-feng,CHEN Xing,GAO Chang-cheng
(KeyLaboratory ofAgricultural Products Processing,Changchun University,Changchun 130022,China)

This paper introduces a new method,G-25 chromatography,to determine the hydrolytic degree of soybean protein,which uses the rapid protein purification system to finish G-25 chromatography in soybean protein hydrolyzed polypeptide solution.The hydrolytic degree of protein is calculated by the proportion of the protein peak and peptide peak.The result shows that the DH value of this method is a little lower than that of the formaldehyde titration method.This method is fast and convenient,it can be used in various kinds of determination of protein hydrolytic degree.

soybean protein;hydrolytic degree;G-25 chromatography

S565.1;Q51

A

1009-3907(2010)06-0025-04

2010-03-30

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目[2008第 365號]

鄒險峰(1971-),男,吉林長春人,講師,博士,主要從事食品生物化學(xué)方面的研究。