蘇惠虹,沈小卓,張小薇

（廣州市醫(yī)藥職業(yè)學校廣東廣州 510430）

動態(tài)濁度法定量測定甘草酸二銨注射液細菌內毒素的含量

蘇惠虹,沈小卓,張小薇

（廣州市醫(yī)藥職業(yè)學校廣東廣州 510430）

目的建立甘草酸二銨注射液的細菌內毒素定量檢查方法,控制藥品質量。方法 采用動態(tài)濁度法,對甘草酸二銨注射液進行干擾預實驗、干擾實驗定量檢測。結果甘草酸二銨注射液在16倍稀釋時無干擾作用。結論用該法檢測甘草酸二銨注射液中的內毒素含量,結果準確,可替代家兔法。

動態(tài)濁度法;細菌內毒素;甘草酸二銨注射液

甘草酸二銨注射液為中藥注射劑,其活性成分為甘草中的甘草次酸左旋構型,是甘草有效成分的第三代提取物,具有較強的抗炎、保護肝細胞膜及改善肝功能的作用。在臨床上用于伴有谷丙氨基轉移酶升高的急、慢性病毒性肝炎的治療。該品種目前《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）（2005版）二部[1]并未收載其熱原檢查方法。國內曾有學者試驗用鱟試劑凝膠法檢測其細菌內毒素[2-6],而采用動態(tài)濁度法未見有報道。筆者參照2005年版《中國藥典》二部細菌內毒素檢查法進行試驗,在原用凝膠法試驗法的基礎上探討動態(tài)濁度法檢測甘草酸二銨注射液細菌內毒素的可行性,以期建立定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.1.1 動態(tài)濁度法鱟試劑（TAL） 規(guī)格 1.2 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批號0610230,可測內毒素范圍:10～0.03 EU/mL。

1.1.2 細菌內毒素工作標準品 規(guī)格150 EU/Amp,中國藥品生物制品檢定所,批號2007-1。

1.1.3 細菌內毒素檢查用水（BET水） 規(guī)格25 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批號0701310。

1.1.4 甘草酸二銨注射液 規(guī)格10 mL/Amp,批號0704072、0704182、0903132,江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司。

1.1.5 ATi/LKL 動態(tài)試管分析儀,由 lab Kinetics Ltd（英國）生產,湛江安度斯生物有限公司總代理;ZH-2自動旋渦混合器,天津藥典標準儀器廠生產;GZX-9246 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產。實驗所用玻璃儀器經250℃干烤1 h除去外源性內毒素。

1.2 方法

1.2.1 細菌內毒素限值（L）的確定 根據藥品細菌內毒素限值:L=K/M,K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量,甘草酸二銨注射液內毒素的閾劑量K=5.0 EU/（kg?h）;M 為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量,甘草酸二銨注射液的M=0.5 mL/kg（本品人用量為1日1次150 mg、30 mL,取人體平均體重為60 kg）,則甘草酸二銨注射液細菌內毒素限值L=K/M=5.0 EU/（kg?h）/0.5 mL/（kg?h）=10 EU/mL。

1.2.2 甘草酸二銨注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 按公式MVD=L/λ,其中L為甘草酸二銨注射液內毒素限值（10 EU/mL）;λ為標準曲線的最低內毒素濃度（0.03 EU/mL）,則甘草酸二銨注射液的最大有效稀釋倍數(shù)MVD為333倍。

1.2.3 標準曲線的制備及可靠性試驗 用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品進行2～10倍稀釋,使其最終濃度分別為2.0,0.25,0.03 EU/mL,各取0.1 mL分別加到預先裝有0.1 mL鱟試劑反應管內,混合均勻,插入設置好的32通道動態(tài)試管儀內進行檢測,其中每一濃度重復3管,并同時取0.1 mL細菌內毒素檢查用水加到裝有0.1 mL鱟試劑反應管內作陰性對照（2管）,當對照管結果不超過標準曲線最低濃度（0.03 EU/mL）時,用測得的反應時間（T）對數(shù)值與對應的細菌內毒素濃度（C）對數(shù)值,即lgT對lgC進行回歸分析,結果見表1。

回歸方程:lgT=0.977 607-0.265 876 lgC,|r|=0.997 930,最低標準內毒素濃度為0.03 EU/mL,反應時間474.0～1 449.0 s,陰性對照反應時間＞3 600 s,在檢測時間外,變異系數(shù)CV（%）≤10%,故標準曲線成立。

表1 標準曲線的可靠性分析

1.2.4 干擾預實驗 甘草酸二銨注射液的最大有效稀釋倍數(shù) 333倍 ,本文僅對 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4個系列濃度進行干擾實驗。方法是將供試品用內毒素檢查用水稀釋成 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4 個系列濃度,在每個濃度下分別取0.1 mL樣品加入0.1 mL鱟試劑作為樣品檢查（NPC）;用對半互稀釋法（50/50）∶如 0.5 mL S4+0.5 mL E0.5（混勻）→0.1 mL S8E0.25,其中E0.25為標準曲線的中點濃度,制備各濃度稀釋液的陽性對照樣品,分別取各濃度陽性對照0.1 mL加入0.1 mL鱟試劑作為樣品陽性對照（PPC）。各濃度樣品及PPC溶液分別平行兩組,插入設置的動態(tài)試管儀內進行檢測,另外還按標準曲線制作方法制備標準曲線及陰性對照（NC）,結果1∶8濃度的樣品,其回收率超過《中國藥典》（2005版）規(guī)定,回收率不在50～200%范圍內,表明有干擾作用。而1∶16、1∶32和1∶64倍系列稀釋濃度樣品回收率均在50～200%范圍內,且變異系數(shù)（CV）均小于10%,標準曲線|r|≥0.980,NC反應時間＞3 600 s。綜合以上情況,決定采用1∶16、1∶32、1∶64倍稀釋液進行干擾實驗。

1.2.5 干擾實驗 為確證 1∶16、1∶32、1∶64倍稀釋液的有效性,進行三個批號甘草酸二銨注射液（0704072、0707182、0903132）正式干擾試驗。其具體操作同1.2.4。結果見表2。

批號0704072回歸方程lgT=1.004 681-0.281 457 lgC,|r|=0.998 040;批號0707182回歸方程lgT=0.799 221-0.325 610 lgC,|r|=0.998 835;批號0903132回歸方程lgT=0.906 868-0.481 056 lgC,|r|=0.987 902。根據《中國藥典》（2005版）規(guī)定,如果藥品陽性對照中內毒素的回收率在50～200%范圍之間無干擾,標準曲線|r|≥0.980,變異系數(shù)（CV%）≤10%,陰性對照（NC）測出內毒素含量小于標準曲線最低濃度λ（本實驗為0.03 EU/mL）,有效。表2結果表明:3批供試品在16倍、32倍和64倍稀釋時均無干擾作用,可以進行定量檢測。

2 結果與結論

甘草酸二銨注射液1∶8倍稀釋對細菌內毒素定量檢查法有干擾,但經稀釋后可以消除干擾作用。本實驗3批樣品經16倍、32倍和64倍稀釋后,依法進行細菌內毒素定量法檢查,其PPC的內毒素回收率均在50%～200%,結果符合藥典規(guī)定。檢測結果和其它熱原檢查的結果一致。證明甘草酸二銨注射液不僅可以用家兔法進行熱原檢查,有學者亦成功用凝膠法進行檢查實驗,而只要將樣品稀釋成16倍、32倍和64倍稀釋液更可用動態(tài)濁度法進行定量檢查。實踐證明,動態(tài)濁度法是可行的,該法不僅比其它方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,更能標準化,迅速得出結果,能更好的在藥品的生產中全程監(jiān)控藥品的質量,值得推廣應用。

表2 甘草酸二銨注射液 1∶16、1∶32、1∶64 倍稀釋液的干擾試驗結果

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2009-11-20）