謝青梅,畢英佐(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642）

禽流感實(shí)用診斷技術(shù)

謝青梅,畢英佐(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642）

禽流感(AI）是由A型流感病毒(AIV）引起的一種禽類病毒性烈性傳染病,OIE把該病定為A類烈性傳染病。許多家禽和野鳥對A型禽流感病毒都有易感性，發(fā)病和危害最大的主要是雞、火雞。鴨、鵝感染H5亞型流感病毒死亡率很高，經(jīng)濟(jì)損失很大。雞感染禽流感后可表現(xiàn)出嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降、致死率很高的急性出血性臨床癥狀；也可表現(xiàn)為輕微的呼吸道感染、輕微產(chǎn)蛋率下降，或者是無癥狀隱性帶毒等亞臨床癥狀；致病力尚弱的毒株逐漸變異為高致病性的毒株，危害雞群的健康。所以快速有效的診斷禽流感病毒是及時(shí)發(fā)現(xiàn)和及早控制禽流感疫情的關(guān)鍵。

一、臨床診斷

（一）基本觀點(diǎn) 禽流感的流行在一定時(shí)間內(nèi)已平息下來，但任何免疫失敗均將導(dǎo)致該病的散發(fā)或呈地方性流行。疫苗毒株和流行野毒株之間有一定差異，需要警惕“非典型”H5N1亞型禽流感病毒的存在與發(fā)生。

高致病性禽流感由H5、H7亞型禽流感病毒引起?；记葜饕憩F(xiàn)為：體溫升高，精神萎頓，毛松，打堆，食欲廢絕，下痢。雞冠發(fā)紺呈暗紅色或蒼白，頭部、面部浮腫，腳鱗出現(xiàn)紫色出血斑。部分病雞出現(xiàn)頭頸和腿部麻痹、抽搐等神經(jīng)癥狀。病程1～2 d，死亡率可達(dá)100%。有時(shí)沒有明顯癥狀即可見到雞只死亡。種雞僅見產(chǎn)蛋下降、畸形蛋多，多由“點(diǎn)”暴發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)槿罕┌l(fā)。鴨、鵝等水禽可見神經(jīng)和腹瀉癥狀，可見眼角膜炎、甚至失明等癥狀。剖檢可見腸道、盲腸扁桃體、胰腺輕微出血，甚至出現(xiàn)喉頭氣管有粘液的“非典型”病變，種雞卵泡變性與壞死、輸卵管炎等。

（二）指示性臨床診斷指標(biāo)

1.未免疫禽群。突發(fā)、急劇的倍數(shù)增長的死亡；萎頓、雞冠發(fā)紺的雞只很快死亡；早期病死雞以全身性出血性變化為主。未免疫雞群出現(xiàn)HI抗體陽性就可確診。

2.免疫禽群。雞群中出現(xiàn)萎頓，雞冠發(fā)紺，趾部角質(zhì)變紅趨向的雞只很快死亡，并延續(xù)數(shù)天，可見腫頭及流淚。病死雞肝臟變化為主，呈現(xiàn)偏淡的多色彩、質(zhì)脆，胰腺、腺胃乳頭出血常見。檢查HI抗體可見群體抗體水平參差不齊，出現(xiàn)一定數(shù)量HI抗體滴度≥12log2的樣本。

3.未免疫鴨。沉郁、明顯的神經(jīng)癥狀，頭頸扭曲、抽搐、癱瘓，臨床癥狀出現(xiàn)后死亡急速上升，死亡率30%～100%。種鴨初期采食下降，產(chǎn)蛋下降可達(dá)10%～90%。

4.免疫鴨。商品鴨發(fā)病日期在20日齡以后，神經(jīng)癥狀和死亡明顯。種鴨產(chǎn)蛋下降30%～60%，很少死亡。

二、鑒別診斷

H9亞型禽流感非常溫和，經(jīng)常與其他疾病一起并發(fā)感染，癥狀和病變均不明顯。H5亞型禽流感和典型雞新城疫癥狀很相似，可根據(jù)以下要點(diǎn)進(jìn)行鑒別診斷（見表1）。

三、禽流感病毒鑒別診斷技術(shù)

目前，禽流感的鑒別診斷技術(shù)很多，常用技術(shù)主要有病毒分離鑒定、病毒血清中和試驗(yàn)和RT-PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、RTLAMP技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)。病毒分離鑒定是傳統(tǒng)可靠的方法，但必須在國家許可的P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在眾多的分子生物學(xué)技術(shù)中最常用的技術(shù)還是RT-PCR技術(shù)，不需要分離病毒，具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)；RT-LAMP技術(shù)是一新型的分子生物學(xué)技術(shù)，不需要分離病毒，不需要昂貴的PCR儀和電泳系統(tǒng)，加入染料后檢測結(jié)果肉眼可視，適合于基層簡易實(shí)驗(yàn)室使用；熒光定量PCR技術(shù)也是非常準(zhǔn)確的分子生物學(xué)技術(shù)，但他需要昂貴的熒光定量PCR儀器和特殊的試劑等，在口岸的檢驗(yàn)檢疫中多用。下面詳細(xì)介紹幾種常用禽流感病毒的檢測技術(shù)。

（一）病毒分離和鑒定采取發(fā)病雞喉拭子、肛拭子或組織器官，加入適量滅菌生理鹽水勻漿，制成10%的懸液，加入雙抗（最終濃度為青霉素1 000 IU/ml、鏈霉素1 000 IU/ml），于 37℃孵育 30 min，然后3 000 r/min離心10～15 min，取上清，再用0.45μm的濾膜過濾除菌，濾液備用。

將處理后的樣品濾液接種于9～11日齡非免疫雞胚，0.2 m1/胚，37℃孵化，每日照蛋2次，棄去18 h內(nèi)死胚，24～48 h死亡雞胚置4℃冷卻4 h或過夜。無菌收獲尿囊液，測定尿囊液對1%雞紅細(xì)胞的血凝活性并觀察雞胚病變。有血凝活性者作進(jìn)一步鑒定；無血凝活性者將其尿囊液和羊水盲傳兩代，仍無血凝活性者棄去。取無菌澄清的尿囊液用于病毒血清型鑒定。采用血凝抑制(HI）試驗(yàn)方法用H5、H9亞型禽流感和新城疫(ND）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行測定。

（二）RT-PCR鑒別診斷技術(shù)RT-PCR方法是鑒別診斷禽流感病毒的非常簡便、快速的方法。分別用H5亞型禽流感病毒（H5 AIV）、H9亞型禽流感病毒（H9 AIV）和新城疫病毒（NDV）特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒別診斷，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶大小判定結(jié)果。在鑒別診斷疑似病例時(shí)，此RT-PCR方法顯示了較大的優(yōu)越性，在臨床診斷上快速鑒別診斷H5、H9亞型AIV和NDV的感染具有重要的實(shí)踐意義。

具體操作如下：取病料或喉拭子，加入適量滅菌生理鹽水勻漿，離心取上清，用RNAout試劑盒（按說明書進(jìn)行）提取總RNA。然后用H5 AIV、H9 AIV和ND對應(yīng)的引物用RT-PCR一步法試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%的凝膠電泳進(jìn)行檢測。若電泳條帶大小為545 bp，就可以初步判定結(jié)果為H5亞型AIV；若電泳條帶大小為488 bp，就可以初步判定結(jié)果為H9亞型AIV；若電泳條帶大小為672 bp，就可以初步判定結(jié)果為NDV。為了進(jìn)一步確診，需要送PCR擴(kuò)增產(chǎn)物到生物工程公司進(jìn)行序列測定，根據(jù)序列分析確診結(jié)果。鑒別診斷的經(jīng)典引物序列如下：

1.H5 AIV上游引物（H5UP）：5,-ACACATGCYCARGACATA CT-3’，下游引物（H5DN）：5,-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3,，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為545bp。

表1 H5亞型禽流感和典型雞新城疫的鑒別診斷

2.H9 AIV上游引物（H9UP）：5,-CTYCACACAGARCACAAT GG-3,，下游引物（H9DN）：5,-G TCACACTTGTTGTTGTRTC-3,，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為488bp。

3.DNV上 游 引 物（NDUP）：5,-TCATACCCAGATTATATCG-3,；下游引物（NDDN）：5,-TGGT AATCTTGTTCATC-3,，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為672bp。

（三）實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)熒光RT-PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的新技術(shù),將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起,在熒光PCR儀中反應(yīng),電腦對整個(gè)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,避免了交叉污染,提高了檢測敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原體、艾滋病病毒等的檢測,熒光RT-PCR方法對PCR產(chǎn)物可以實(shí)時(shí)監(jiān)控,省卻了電泳和EB染色；由于采用特異性熒光探針和高靈敏度熒光PCR儀,比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100～1 000倍。在檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中常用。深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局與深圳太太基因工程有限公司聯(lián)合研制了同時(shí)檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的實(shí)時(shí)熒光多重RT-PCR檢測試劑盒，廣泛用于口岸的檢驗(yàn)檢疫中。

（四）RT-LAMP診斷技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP）是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)4種特異引物（2條外引物和2條內(nèi)引物），利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase）在恒溫(65℃左右）中反應(yīng)1 h，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果可根據(jù)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行判斷；也可以在終產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，直接用肉眼觀察結(jié)果,而不需模板熱變性、長時(shí)間的溫度循環(huán)、凝膠電泳、紫外觀察等過程。國外有報(bào)道用RT-LAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒,還用于鑒定流感A、B型的診斷。H5亞型禽流感病毒RT-LAMP技術(shù)是一種檢測H5亞型禽流感病毒的有效快速的可靠方法,對生產(chǎn)實(shí)踐具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。

H5亞型禽流感病毒的RTLAMP方法具體操作為：從組織勻漿或尿囊液中提取AIV總RNA 作 為 模 板。 在 25 μl反 應(yīng)體系中分別加入以下組分:10×buffer 2.5 μl,dNTPs(2.5 mmol/L）4 μl,FIP/BIP(10 μmol/L）2 μl,引 物 F3/B3(10μmol/L）0.5 μl,Bst DNA polymer-ase 1μl(8U/μl）,AMV反 轉(zhuǎn) 錄 酶1μL(100U/μl）,RNA 5 μl,DEPC 水 6.5 μl?；靹蚝?42℃保溫10 min，之后在65℃擴(kuò)增60 min,最后80℃反應(yīng)10 min終止反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物可以用0.02 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L的溴化乙錠）電泳檢測,電泳條件為80 V、30 min，用VL凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果；或者在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，陽性結(jié)果會呈現(xiàn)綠色，不需用瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)典的檢測H5亞型禽流感病毒的LAMP引物如下：

外引物F3: 5,-GCCATTCCA CAACATACACCC-3,；

內(nèi)引物FIP:5,-CTGAGTCCA GTCGCAAGGACTAATCTGTTTT-TCTCACCATCGGGGGAA TGCC-3,;

內(nèi)引物BIP: 5,-GGATGGCA GGGAATGGTAGAT-GG-TTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATTG C-3,；

外引物B3: 5,-TGGTGACTC CATCTATTGCCT-3,。

(五）其他技術(shù)禽流感病毒檢測技術(shù)還有膠體金試紙條技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)、基因芯片技術(shù)、TEMPCR技術(shù)等檢測技術(shù)，這些技術(shù)目前看來還是不太適合于普通實(shí)驗(yàn)室使用。禽流感監(jiān)測和診斷技術(shù)的研究在不斷的深入和拓寬，這對防控禽流感有非常重要的意義。