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        豬弓形蟲病血清流行病學調(diào)查與分析

        2010-09-17 08:50:18劉靖清
        獸醫(yī)導刊 2010年4期
        關(guān)鍵詞:弓形蟲血凝稀釋液

        劉靖清,張 亮,袁 濤

        (1.鹽城市畜牧獸醫(yī)局,江蘇鹽城 224002;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州 730046)

        豬弓形蟲病血清流行病學調(diào)查與分析

        劉靖清1,張 亮2,袁 濤2

        (1.鹽城市畜牧獸醫(yī)局,江蘇鹽城 224002;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州 730046)

        弓形蟲病是龔第弓形蟲引起的一種人和多種動物共患寄生蟲病。豬肉被認為是引起人感染弓形蟲病的主要傳染源,鑒于弓形蟲病對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失以及先天性弓形蟲病對優(yōu)生優(yōu)育的重要影響和獲得性弓形蟲病對免疫功能低下病人的嚴重危害。應(yīng)將該病的診、治、防工作作為研究重點。

        弓形蟲這一病原體于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的嚙齒類梳趾鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn),并正式命名。幾乎同時,Splendole亦于1908年在巴西一個實驗室的家兔體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了弓形蟲。自此以后,陸續(xù)在世界各地的人和動物中發(fā)現(xiàn)弓形蟲病。我國于20世紀50年代首先在福建的貓、兔等動物體發(fā)現(xiàn)了本病病原體,但直至1977年后才陸續(xù)在上海、北京等地發(fā)現(xiàn)過去所謂的“無名高熱”是由弓形蟲引起的,并引起普遍的重視。弓形蟲病宿主種類十分廣泛,和動物感染率都很高。據(jù)國外報道,人群的平均感染率25%~50%,有人推算全世約1/4的人感染弓形蟲。在免疫缺陷和免疫抑制病人合并感染弓形蟲可導致腦炎發(fā)生。豬暴發(fā)弓形蟲病時,可使整個豬場發(fā)病,死亡率高達60%以上。其它家畜如牛、羊、馬、犬和實驗動物等也都能感染弓形蟲。因此本病給人類健康和畜牧發(fā)展帶來很大危害和威脅。目前各省市各種動物均有本病的存在。其特征表現(xiàn)為高熱稽留,呼吸困難,皮膚發(fā)紺,流產(chǎn),便秘或腹瀉。臨床可見急性、亞急性和慢性三種病型,嚴重的可引起死亡。是目前危害養(yǎng)殖業(yè)的一種重要的寄生蟲性疾病,磺胺類藥物對弓形蟲有很好的療效,臨床上常用的磺胺六甲氧嘧啶、磺胺五甲氧嘧啶、復合磺胺嘧啶鈉、強化長效抗菌劑、甲氧芐胺嘧啶(TMP)和磺胺甲氧吡嗪(SMP2)等都是很好的治療藥物。用藥時要注意“用早藥、療程足”的治療方針,病情控制后應(yīng)繼續(xù)治療1~2 d,效果較好。

        一、材料和方法

        (一)材料

        1.抗原。弓形蟲間接血凝實驗凍干抗原,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),批號為20070718。用于檢測人和動物血清或濾紙干血滴中的弓形蟲抗體,效價不低于1∶1024。用前按標定毫升數(shù)用滅菌蒸餾水稀釋搖勻,1 500~2 000 r/min離心5~10 min,棄去上清液,加等量稀釋液(PDS與兔血清)搖勻,置4℃左右24 h后使用。稀釋后作為診斷液,4℃左右保存,10 d內(nèi)效價不變。

        2.標準陽性和陰性血清。弓形蟲標準陽性血清(效價不低于1∶1024),中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),批號為20070718。弓形蟲標準陰性血清,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),批號為20070718。

        3.被檢血清。采自甘肅省11地區(qū)的定點屠宰場、養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶等動物的血清534份。成年豬從耳靜脈采血,每頭動物采血3~5 ml。37℃靜置0.5~1 h后(或2 000 r/min離心5 min)分離血清約1.5 m1,置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        4.稀釋液。稀釋液,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),批號為20070718。

        自配稀釋液。先配制含0.1%迭氮鈉的pH7.2, 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),稱取磷酸氫二鈉19.34 g、磷酸二氫鉀2.86 g、氯化鈉4.25 g、迭氮鈉1.00 g,雙蒸餾水或無離子水溶解并加至1 000 ml,過濾后分裝,10磅15 min高壓滅菌。取含0.1%迭氮鈉的PBS 98 ml、56℃滅活30 min的健康兔血清2 ml,混合,無菌分裝,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        5.病豬與病料。武威市某豬場飼養(yǎng)發(fā)病豬群;無菌采取病死豬肺門淋巴結(jié)、肺、肝、脾等臟器組織。

        6.主要試劑。

        (1)瑞氏染液。市售的瑞氏染色粉0.2 g,加無水中性甲醇100 ml,溶解后移入棕色小口試劑瓶中,加塞,置室溫下,每日搖動45 min,一周后可用。

        (2)姬氏染液。取市售姬氏染色粉0.5 g,中性純甘油25.0 ml,無水中性甲醇25.0 ml。先將姬氏染色粉置研缽中,加少量甘油充分研磨,再加再磨,直到甘油全部加完為止,將其倒入100 ml的小口試劑瓶中,在研缽中加少量的甲醇以沖洗甘油染液,沖洗液仍傾入上述瓶中,再加再洗再傾入,直到25 ml甲醇全部用完為止。塞緊瓶塞,充分搖勻,而后將瓶置于65℃溫箱中24 h或室溫3~5 d,并不斷搖動,即為原液。取原液2.0 ml,加到中性蒸餾水100 ml中,即為染液。

        (3)血瓊脂培養(yǎng)基。將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱融化,冷至45℃~50℃,加入無菌鮮血達5%(即每100 ml營養(yǎng)瓊脂中加入鮮血5~6 ml),分裝于試管中,擺成斜面,或傾注于平皿,待凝固后,置37℃培養(yǎng)1~2 d,有污染者廢棄,無菌者保存于冰箱備用。

        (4)無菌鮮血。無菌手術(shù)法采取健康動物(通常是綿羊或家兔)血液,加入盛有無菌5%檸檬酸鈉溶液的容器中(血與5%檸檬酸鈉的比例約為9∶1),混勻,置冰箱中保存。

        (5)青霉素、鏈霉素。購自華北制藥廠。

        7.主要儀器。微量移液器(25μ l,75 μ l, 1 000 μ l),微量血凝反應(yīng)板(96孔),隔水式恒溫培養(yǎng)箱,溫度范圍5℃~60℃,離心機4 000 r/min,超生波清洗器,微量攪拌器。

        (二)方法

        1.弓形蟲病的血清學調(diào)查。采用弓形蟲病間接血凝試驗,對采自甘肅省11個地區(qū)的豬血清樣品進行檢測。取V型微量反應(yīng)板,按以下步驟操作。

        ⑴加稀釋液。用移液器將稀釋液加入96孔V型反應(yīng)板上,每孔0.075 ml。定性檢查時,每個樣品加4孔,定量則加8孔。每塊板上均應(yīng)設(shè)陽、陰性血清對照,對照均加8孔。

        ⑵加待檢血清和陰、陽性對照血清,并作梯度稀釋。第一孔加相應(yīng)血清0.025 ml,混勻后取0.025 ml加入第二孔中,混勻后取0.025 ml加入第三孔中,以此類推。定性檢查時稀釋至第3孔后,取0.025 ml棄去,第4孔為稀釋液對照;定量檢查與對照均稀釋至第7孔后,取0.025 ml棄去,第8孔為稀釋液對照。

        ⑶加診斷液。每孔加診斷液0.025 ml,加完后將反應(yīng)板置微型振蕩器上震蕩1~2 min,直到診斷液中的血球分布均勻。取下反應(yīng)板,蓋上一塊玻璃板或干凈紙,以防落入灰塵,置22~37℃,2~3 h后觀察結(jié)果。

        表1 甘肅省各地區(qū)豬弓形蟲感染情況

        表2 不同月齡豬弓形蟲感染情況

        表3 不同地區(qū)豬抗體滴度分布

        ⑷結(jié)果判定。陽性對照血清滴度不低于1∶1024(第5孔),陰性對照血清除第1孔允許存在前滯現(xiàn)象(+),其余各孔均為(-),稀釋液對照為(-)。依據(jù)判定標準對被檢血清進行判定。(++++):100%紅細胞在孔底呈均質(zhì)的膜樣凝集,邊緣整齊、致密(因動力關(guān)系,膜樣凝集的紅細胞有的出現(xiàn)下滑現(xiàn)象);(+++):75%紅細胞在孔底呈膜樣凝集,不凝集的紅細胞在孔底中央集中成很小的圓點;(++):50%的紅細胞在孔底呈稀疏的凝集,不凝集的紅細胞在孔底中央集中成較大的圓點;(+):25%的紅細胞在孔底凝集,其余不凝集的紅細胞在孔底中央集中成大的圓點;(-):所有的紅細胞均不凝集,并集中于孔底中央呈規(guī)則的最大的圓點。以被檢血清抗體滴度達到或超過1:64判為陽性,判(++)為陽性終點。

        二、結(jié)果

        (一)豬弓形蟲感染情況通過間接血凝試驗調(diào)查了534頭家畜血清抗體陽性55頭(個),平均陽性率為10.29%.

        (二)不同地區(qū)豬弓形蟲感染情況通過間接血凝試驗調(diào)查了11個地區(qū)的534頭豬弓形蟲感染情況,結(jié)果見表1。其中,血清抗體陽性55頭,平均陽性率為10.29%。

        (三)不同月齡的豬感染情況通過間接血凝試驗分別對武威地區(qū)6~13個月齡豬弓形蟲感染情況進行調(diào)查,結(jié)果見表2。其中,抗體陽性37頭,平均陽性率11.07%。

        (四)抗體滴度分布弓形蟲血清抗體陽性的家畜中,豬抗體滴度最高達1∶1024。在55份陽性血清中,1∶64的有35份,占63.63%,1∶ 256的有16份,占29.09%,1∶1024有4份,占7.27%不同地區(qū)豬的抗體滴度分布情況見表3。

        三、結(jié)論

        1.調(diào)查表明,各地豬均有弓形蟲感染,平均陽性率為10.29%

        2.調(diào)查的55份陽性血清中,1∶256有 16份, 占 29.09%,1∶1024有4份,占7.27%,所以屬急性感染者20份,占36.36%。

        3.從豬弓形蟲陽性檢出率為10.29%來看,目前豬弓形蟲病還比較嚴重,同時,確診武威地區(qū)某養(yǎng)豬場育肥豬患有弓形蟲病。

        4.農(nóng)戶散養(yǎng)、個體飼養(yǎng)場以及小規(guī)模飼養(yǎng)場的豬弓形蟲陽性率明顯高于大規(guī)模飼養(yǎng)場,這主要與衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)水平、管理方式有關(guān)。不同月齡豬的弓形蟲感染率沒有明顯的差異,也沒有嚴格的季節(jié)性,但秋冬季和早春發(fā)病率高,可能與此時動物機體抵抗力較低有關(guān)。養(yǎng)豬場除了要做好滅鼠、驅(qū)貓工作外,還應(yīng)防范飼料污染,特別是從農(nóng)戶收購飼料原料的場,要了解原料與貓的接觸情況,以防止通過污染飼料渠道感染弓形蟲。

        (略)

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