宋永貴， 蘇 丹， 耿璐璐， 孫立新*

(1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016;2.遼寧省撫順市藥品檢驗所，遼寧撫順113006)

通達顆粒是在中醫(yī)臨床驗方和現(xiàn)代藥理學研究基礎上，由白芍、紅花、黃芩、川芎、天麻、莪術、蒲公英等藥組成，具有活血祛瘀、行氣止痛、清熱利濕的功效［1-4］。主要用于輸卵管黏連、堵塞導致的不孕不育癥。其中，君藥紅花、白芍，養(yǎng)血和血、逐瘀消癥;臣藥川芎、黃芩行氣止痛、清熱解毒。為了多指標嚴格控制產品質量，以方中君藥紅花、白芍的主要有效成分羥基紅花黃色素A和芍藥苷，臣藥黃芩、川芎的主要成分黃芩苷和阿魏酸作為控制本品質量的指標成分。目前關于黃芩苷、芍藥苷和阿魏酸的含量測定方法報道較多［5-7］，但同時測定上述4種成分的方法尚未見文獻報道。本試驗根據(jù)4種成分不同的紫外吸收特征，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器連用儀器在線監(jiān)測多個波長的優(yōu)勢，在不同紫外檢測波長下，對上述4種活性成分同時測定含量。該方法分離效果好、快速、準確、重現(xiàn)性好，為通達顆粒的質量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，SCL-10A型 DAD檢測器(日本 Shimadzu公司)，AB135-S天平(瑞士 Metrler toledo公司)。水為重蒸水，除甲醇、磷酸為色譜純外，其他所用試劑均為分析純。供含量測定用芍藥苷對照品(批號:110736-200423)、羥基紅花黃色素A對照品(批號:111637-200301)、阿魏酸對照品(批號:0773-9910)和黃芩苷對照品(110715-200514)均購自中國藥品生物制品檢定所，通達顆粒(自制，批號為20080316，20080318，20080320)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取本品適量，研細，取約1.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，搖勻，稱重，超聲20 min使溶解，放冷，稱重，用70%甲醇水補足損失的重量，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取在60℃減壓干燥2 h的各對照品適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的濃度分別為0.104、0.512、0.154 4、0.65 mg/mL。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備不含白芍、紅花、川芎、蒲公英或黃芩的制劑陰性樣品按2.1.1項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

色譜柱為Alltech Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫［75%B→65%B(0～10 min)，65%B→63%B(10～20 min)，63%B→48%B(20～35 min)，48%B→43%B(35～45 min)］;流速為1.0 mL/min;檢測波長為230 nm(羥基紅花黃色素A，芍藥苷)，315 nm(阿魏酸，黃芩苷);柱溫:30℃;進樣量:20 μL。在上述色譜條件下，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，得到對照品、樣品及陰性色譜圖見圖1～6。

圖1 對照品HPLC色譜圖

圖2 樣品HPLC色譜圖

圖3 缺紅花陰性對照樣品HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察

圖5 缺川芎、蒲公英陰性對照樣品HPLC色譜圖

圖6 缺黃芩陰性對照樣品HPLC色譜圖

精密量取各對照品溶液 0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。取上述混合溶液各20μL進樣，在上述色譜條件下進行分析。用峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，結果表明羥基紅花黃色素A芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的回歸方程分別為:Y=2.303×105X+5.418×104(r=0.999 1)、Y=1.289×105X+1.620×104(r=0.999 6)、Y=2.604×104X+1.288×103(r=0.999 5)、Y=1.044 ×104X+1.499 ×103(r=0.999 5)。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的線性范圍分別為 5.20～104 mg/L，25.6～512 mg/L，7.72～154.4 mg/L和32.5～650 mg/L。

2.4 精密度試驗

取芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和黃芩苷的混合對照品溶液，在上述色譜條件下，重復進樣6次，測定峰面積。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷峰面積的 RSD分別為1.9%、2.7%、2.0%和1.5%。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一批號樣品(20080316)6份，按2.1.1項下方法操作，在上述色譜條件下進行分析測定，計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷含量的RSD分別為1.5%、1.5%、2.1%和1.2%。

2.6 回收率試驗

取已知含量的通達顆粒((20080316)適量，研細，取約0.6 g共9份，精密稱重，3份為1組，每3組按低、中、高濃度分別精密加入羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷對照品溶液，依2.1.1項下方法操作。結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=9)

2.7 溶液穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，室溫下放置，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h測定，結果表明，供試品溶液在10 h內穩(wěn)定性良好，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.6%、1.9%、1.6%和1.5%。

2.8 樣品的測定

取3批通達顆粒，每批取3份，依2.1.1項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，以外標法二點法計算樣品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、黃芩苷的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 梯度條件的確定 為了使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時間合理，采用梯度洗脫方法。羥基紅花黃色素A極性較大，適合在水比例較大的系統(tǒng)中分離，而黃芩苷極性相對較小，適宜在乙腈比例較大的系統(tǒng)中分離，4種成分同步檢測時，調節(jié)梯度比例，由水相向乙腈相增大。在此調整過程中，曾嘗試將乙腈增大，黃芩苷出峰時間提前，但梯度變化太快，基線不平穩(wěn)，有較大坡度，故最終確定35 min到45 min范圍內，水相比例由48%到43%，梯度平緩，基線平穩(wěn)。保證了4種成分同時測定的情況下，節(jié)省分析時間。

3.1.2 流動相系統(tǒng)的確定 本研究曾分別采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸酸水溶液、甲醇-0.2%醋酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液等流動相體系。結果相比于甲醇，使用乙腈所得到的色譜峰，峰形更加尖銳，理論塔板數(shù)更高。由于阿魏酸含有酚羥基，具有酸性，采用了反相離子抑制色譜，在流動相中添加少量酸，抑制其解離，解決了其色譜峰拖尾和展寬的問題。較醋酸水系統(tǒng)，本實驗條件下的磷酸水系統(tǒng)，分離效果更好，基線更平穩(wěn)，樣品色譜中4個成分的峰形好，與雜質峰的分離度均大于1.5。最終確定乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)為流動相。

3.1.3 檢測波長的確定 由于4個成分光譜差異大，采用二極管陣列檢測器對4種成分同時測定。在選擇檢測波長的過程中，為了使定量過程盡量簡便，且考慮到在芍藥苷最大吸收波長230 nm處，羥基紅花黃色素A吸收強度大，分離效果較理想，將這2個成分的檢測波長定為230 nm。阿魏酸最大吸收波長315 nm，黃芩苷最大吸收波長330 nm，考慮到通達顆粒中黃芩苷含量較大，阿魏酸含量較小，故將這2個成分的檢測波長定為315 nm。

3.2 供試品與陰性樣品制備方法的考察

本實驗采用超聲提取方法并考察了溶媒(水、甲醇、70% 甲醇)和超聲時間(10 min，20 min，30 min)對提取效率的影響。結果顯示，水為溶媒，提取的供試品雜質干擾多，羥基紅花黃色素A與雜質峰不能達到基線分離。而以70%甲醇為溶媒，超聲20 min已可將樣品中芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和黃芩苷提取完全，雜質峰不干擾測定。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和黃芩苷分別為通達顆粒處方中紅花、白芍和黃芩的指標性成分，而阿魏酸是川芎和蒲公英均含有的有效成分，故在阿魏酸陰性樣品的制備中采用了同時缺川芎和蒲公英藥材的制劑陰性樣品。

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