崔紅花， 趙英日， 沈志濱﹡， 丁金龍， 尹永芹， 陳 超

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)國際學(xué)院，廣東廣州510405)

花椒為蕓香科植物青椒Zanthoxylum Schini folium Sieb.et Zucc.或花椒 Zanthoxylum bungeanun Maxim.的干燥成熟果實，其味辛，性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)。有溫中止痛、殺蟲止癢之功效，用于脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，蟲積腹痛，蛔蟲癥，外治濕疹瘙癢［1］。我國花椒主產(chǎn)于四川、陜西、河北、江蘇及廣東等地?；ń樊a(chǎn)地不同、提取方式不同，其揮發(fā)油組分各有不同［2］?；ń窊]發(fā)油具有特殊的辛辣香味，經(jīng)精制加工后，可作為調(diào)制熏衣草型香精的原料，還可藥用［3］。目前花椒揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、油樹脂提取法等［4］，其中又以水蒸氣提取法的應(yīng)用最多，采用水蒸氣進行提取有提取設(shè)備簡單、操作簡單、經(jīng)濟易行、品質(zhì)好、對溶劑純度要求不高等優(yōu)點，較為適用于大生產(chǎn)。參閱有關(guān)水蒸氣提取花椒揮發(fā)油的文獻，尚未見有多指標(biāo)優(yōu)選水蒸氣提取花椒揮發(fā)油工藝的報道。本文采用均勻設(shè)計多指標(biāo)試驗篩選了浸泡時間、加熱提取時間、提取溶劑量以及藥材粒度對廣東產(chǎn)花椒中揮發(fā)油的提取率及化學(xué)成分的影響，并優(yōu)選出最佳工藝條件，為生產(chǎn)和科研提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 花椒藥材，購自廣州清平藥材市場，產(chǎn)地:廣東，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室李書淵教授鑒定為蕓香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum maxin)的干燥成熟果實;無水乙醚、無水硫酸鈉，均為分析純;水為自制超純水。

1.2 儀器 HP5890GC/HP5972MS氣/質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，1μL微量進樣器(上海安亭科學(xué)儀器廠)，AY120型電子分析天平(上海島津商貿(mào)有限公司)，TC-15型恒溫電熱套(海寧市華星儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗方法 將花椒藥材粉碎，過篩，精密稱取30 g，置于500 mL燒瓶中，加一定量水與數(shù)粒玻璃珠，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，進行揮發(fā)油提取，收集揮發(fā)油，所得揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，過濾并計算揮發(fā)油的含量(%)。各次試驗中該條件保持不變，按照均勻設(shè)計安排進行試驗，以提取物得率及化合物為評價指標(biāo)，考察各因素水平對揮發(fā)油提取效果的影響，得出最佳工藝條件。

2.2 均勻試驗設(shè)計 通過預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)對揮發(fā)油提取物得率影響最大的因素有提取時間、浸泡時間、溶劑量、粉碎度。本試驗選用均勻試驗設(shè)計表(94)表進行最佳提取工藝的篩選。因素水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2。

表1 均勻設(shè)計試驗因素水平表

表2 均勻設(shè)計試驗安排及結(jié)果表

2.3 提取率為指標(biāo)的結(jié)果與數(shù)據(jù)處理 將表2得到的結(jié)果利用均勻設(shè)計數(shù)據(jù)處理軟件(DPS 9.50標(biāo)準(zhǔn)版)進行均勻設(shè)計回歸分析，回歸數(shù)學(xué)模型為:Y=0.010 692+0.003 667X1－0.000 626X2+0.001 974X3－0.000 091X4;顯著水平 p=0.271 8;F=1.918 2;相關(guān)系數(shù)R=0.810 755;決定系數(shù)R2=0.657 3;剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.007 765;調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.560 935。根據(jù)回歸方程，求出最佳組合見表3。

表3 均勻設(shè)計試驗提取率最佳組合

回歸系數(shù)t檢驗的結(jié)果見表4。被引入的有4個回歸項，即 X1、X2、X3、X4，其中 X1和 X2差異顯著，說明提取時間和浸泡時間對花椒揮發(fā)油提取率影響較大。

表4 各回歸項回歸系數(shù)的t檢驗結(jié)果

由回歸方程因素的系數(shù)可見提取時間和加水量對花椒揮發(fā)油成分的提取率的影響為正效應(yīng)。由最優(yōu)方案可知:提取時間和水量為最大值(X1=5.159 5 min，X3=12.576 0倍)，藥材目數(shù)取中等水平(X4=26.961 8目)，浸泡時間取最小值(X2=20.899 4 min)，說明在加大加水量，盡可能加長提取時間可使花椒揮發(fā)油提取率升高。

2.4 花椒揮發(fā)油的GC-MS分析

2.4.1 氣相色譜條件 色譜柱:Cpsil 5CB(Varian)30 m×0.25 nm×0.25 mm(100%苯甲基硅氧烷);柱溫:80℃;程序升溫:起始溫度80℃保持5 min，以1℃/min升溫至130℃，以2℃/min升溫至200℃，保持5 min;載氣:He氣;載氣流量:1.0 mL/min;進樣方式:不分流進樣;進樣量:1μL(無水乙醚溶液);進樣口溫度:280℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為EI源;電離電壓:70 ev;電子倍培電壓:1 976 mV;質(zhì)譜Temp=169℃;Vacuum:64 mTorr;溶劑延時:5 min;質(zhì)譜掃描范圍:50～550 aum;掃描質(zhì)量范圍:50～550 m/z;樣品經(jīng)峰純度檢測，Wiley 138譜庫檢索。

2.4.3 揮發(fā)油成分分析 按上述的色譜-質(zhì)譜條件對花椒揮發(fā)油進行分析，獲得總離子流圖。經(jīng)分析確定的37種化合物及其相對百分含量如表5所示。由表5可知，用無水乙醚溶解的揮發(fā)油樣品通過氣相色譜儀，隨著程序設(shè)置的溫度逐漸升高，使得化合物按沸點由低至高依次氣化，順次進入質(zhì)譜檢測儀中裂解，獲得各單體化合物的質(zhì)譜圖。共分離出43個峰，通過Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并參照標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照鑒定，鑒定37個成分，主要成分為桉葉油醇、芳樟醇、(－ )-4-萜品醇、α-萜品醇。

2.4.4 揮發(fā)油化學(xué)成分為指標(biāo)的均勻分析 由于消費者對產(chǎn)品的要求越來越多樣化，所以在均勻設(shè)計試驗中，需要考察的指標(biāo)不止一個，而是在2個或2個以上。這種試驗稱為“多指標(biāo)試驗”。本次試驗采用的是均勻試驗，對試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的分析從各方面考慮，綜合決定因素主次及最優(yōu)水平組合。常用的對多指標(biāo)試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的分析有“綜合評分法”，是一種將多指標(biāo)按著一定的規(guī)則轉(zhuǎn)換為單指標(biāo)的方法。本試驗利用一個包含有各項指標(biāo)加權(quán)系數(shù)(權(quán)值)的公式計算每號試驗結(jié)果的綜合評分。加權(quán)系數(shù)的大小體現(xiàn)了各項指標(biāo)的重要程度。這種方法對指標(biāo)乘以相應(yīng)的加權(quán)系數(shù)得該項指標(biāo)的加權(quán)評分，再把每號試驗的所有指標(biāo)的加權(quán)評分相加即得綜合評分。

表5 花椒揮發(fā)油化學(xué)成分的相對百分含量/%

多指標(biāo)綜合評價中評價指標(biāo)與權(quán)重系數(shù)確定將直接影響綜合評價的結(jié)果。在本試驗中綜合考慮了藥效與化學(xué)成分含量高低，并結(jié)合文獻將本次實驗分離鑒定出的花椒揮發(fā)油化學(xué)成分中揮發(fā)油主要有效成分并峰面積較大的成分有桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-松油醇和 β-欖香烯，故給予12%的加權(quán)系數(shù)，另外將次要主分及含量相對較低的乙酸芳樟酯、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯等，給予2%的加權(quán)系數(shù)，其余均給予1%的加權(quán)系數(shù)，其花椒油中各化合物峰面積及加權(quán)系數(shù)見表6，所得綜合評分結(jié)果見表7。

將表7得到的結(jié)果利用均勻設(shè)計數(shù)據(jù)處理軟件(DPS9.50標(biāo)準(zhǔn)版)進行均勻設(shè)計回歸分析，得到回歸方程:Y=1 128 560 420.75－294 232 738.13X1+35 356 118.93X2－9 558 106.77X3－6 936 878.76X4;顯著水平p=0.089 5;F=4.423 0;相關(guān)系數(shù)R=0.903 105;決定系數(shù)R2=0.82;剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=439 874 431.94;調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.79。根據(jù)回歸方程，得到最佳組合見表8。

回歸系數(shù)t檢驗的結(jié)果見表9。被引入的有4個回歸項，即 X1、X2、X3、X4，其中 X1和 X2差異顯著，說明提取時間和浸泡時間對花椒揮發(fā)油化學(xué)成分影響較大。

由回歸方程因素的系數(shù)可見浸泡時間對花椒揮發(fā)油成分的提取率的影響為正效應(yīng)。由最優(yōu)方案可

表6 花椒揮發(fā)油化學(xué)成分的峰面積及加權(quán)系數(shù)

表7 均勻設(shè)計花椒揮發(fā)油化學(xué)成分綜合評分試驗數(shù)據(jù)

表8 化學(xué)成分為指標(biāo)均勻設(shè)計試驗最佳組合

表9 各回歸項回歸系數(shù)的t檢驗結(jié)果

知:提取時間、加水量和藥材目數(shù)為最小值(X1=1.064 0 min，X3=8.512 0 倍，X4=4.178 4 目)，浸泡時間取最大值(X2=63.793 9 min)，說明加長浸泡時間的話，在縮短提取時間也能提取出較優(yōu)質(zhì)的揮發(fā)油。

2.4.5 揮發(fā)油化學(xué)成分直觀分析 我們由9個花椒樣品揮發(fā)油特征圖譜及表5發(fā)現(xiàn)，在不同的提取條件下，水蒸氣提取花椒揮發(fā)油得出的揮發(fā)油成分有較大差異。從全部提取工藝中分離鑒定出37化合物，見表10，其中含氧有機化合物18種，占被測成分種類的50%，其中組分中含量最多的是桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-萜品醇;而烴類化合物中占組分含量較多的是β-欖香烯，另外，醋酸酯類如酸芳樟酯、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯等都有較高的含量。

表10 花椒揮發(fā)油的各化學(xué)成分信息

3 討論

均勻試驗數(shù)據(jù)用處理軟件DPS 9.50標(biāo)準(zhǔn)版作回歸處理所得，最優(yōu)條件為對于花椒揮發(fā)油提取率來說提取條件是:浸泡時間20 min、加熱提取時間5 h、提取溶劑量12倍以及藥材粒度24目;對于揮發(fā)油化學(xué)成分來說提取條件為:浸泡時間60 min、加熱提取時間1 h、提取溶劑量8倍以及藥材搗碎。

本試驗提取揮發(fā)油的溶劑是水，提取得到的成分以單萜和倍半萜為主，設(shè)計了多指標(biāo)均勻試驗，每個水平試驗得到的揮發(fā)油成分存在差異，共同的成分為桉葉油醇、芳樟醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇、香芹酮、3甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-酮、乙酸芳樟酯、乙酸冰片酯、1-P-Menthen-8-Ylacetate、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯、β-欖香烯、β-甜沒藥烯等。從沸點角度探討，改變揮發(fā)油提取時的溫度條件，可以提高揮發(fā)油中倍半萜的提取率，因為倍半萜類是揮發(fā)油高沸程(250～280℃)的主要成分。通過改變提取條件，可以提取出不同的揮發(fā)油成分。

本次實驗選用的是廣東產(chǎn)的花椒，主要化學(xué)成分為桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-萜品醇、香芹酮等，上述檢出物質(zhì)種類、含量等方面與其他文獻的報道有所差別，文獻中報道［5］蜆殼花椒中含量較高的生物堿類化合物未被檢出;而在本工作中被檢出含量較高的醋酸酯類化合物，在岳陽花椒中未曾有報道檢測出的情況［6］。由此可見花椒揮發(fā)油化學(xué)成分間的差異與花椒的產(chǎn)地和品種有著密切的聯(lián)系。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:110.

［2］李建紅，張水華，孔令會.花椒研究進展［J］.中國調(diào)味品，2009，34(2):28-35.

［3］季永芹，劉崇慧.花椒的藥用價值［J］.中國民間療法，2003，11(7):46-47.

［4］路純明，張小麟.花椒揮發(fā)油提取方法及組分分析［J］.中國糧油學(xué)報，1996，11(4):12-16.

［5］湯 俊，朱 衛(wèi)，屠治本.蜆殼花椒化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，1995，26(11):563-565.

［6］閻建輝，唐課文，許 友，等.GC/MS法分析花椒揮發(fā)油的化學(xué)成分［J］. 質(zhì)譜學(xué)報，2003，24(2):326-330.