倪書(shū)茂， 錢大瑋*， 段金廒*， 郭建明， 王振中， 尚爾鑫， 孫國(guó)玲

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210046;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港222001)

大川芎方源于金·劉完素《宣明論方》卷二，川芎和天麻配伍組成為4∶1，具有活血化瘀、息風(fēng)止痛的功效，主治首風(fēng)眩暈，及胃膈痰飲，偏頭痛，身體拘倦。通過(guò)內(nèi)外兼治，治療瘀血阻滯、風(fēng)熱上擾所致的頭痛諸證［1］。藁本內(nèi)酯、天麻素是該方的主要有效成分，是治療偏頭痛的主要效應(yīng)組分［2，3］。有關(guān)藁本內(nèi)酯、天麻素及大川芎方的藥代動(dòng)力學(xué)、藥理作用研究較多，但對(duì)大川芎方提取物給藥后主要有效成分藁本內(nèi)酯及天麻素在體內(nèi)代謝物研究的報(bào)道尚未見(jiàn)。為了探討大川芎方給藥后藁本內(nèi)酯及天麻素在體內(nèi)的代謝物及其代謝途徑，本文采用 UPLCQTOF/MS聯(lián)用技術(shù)，將 MSE數(shù)據(jù)采集模式與MetaboLynxTM軟件的質(zhì)量虧損過(guò)濾(DMF)技術(shù)結(jié)合，對(duì)家兔灌胃大川芎方提取物后在血漿中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物進(jìn)行分析鑒定，為大川芎方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 儀器和動(dòng)物及試藥

儀器 AcquityTMUPLC系統(tǒng)(Waters公司);SynaptTMQ-TOF質(zhì)譜儀(Waters公司)，配有Lock-spray接口;電噴霧離子源(ESI);MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站(Waters公司)，MetaboLynxTM軟件(Waters公司);DZ 30-32高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);WH-1微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，電子天平(BT125，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

動(dòng)物 新西蘭家兔，體重1.8～2.0 kg，♀♂各半，由南京江寧縣湯山青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2007-0008。

試藥 川芎產(chǎn)于四川，天麻產(chǎn)于安徽，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定，分別為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖和蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。天麻素對(duì)照品(110807-200205，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、藁本內(nèi)酯與正丁烯基苯酞(自制，HPLC歸一化法分析純度達(dá)98%)。乙腈(HPLC級(jí)，TEDIA公司)，其他試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

色譜分析條件 Waters AcquityTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.7μm);柱溫30 ℃;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量5μL;流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫:0～15 min:3% ～95%A，15～25 min:95% ～95%A。

質(zhì)譜檢測(cè)條件 ESI源，掃描方式:ESI+模式，毛細(xì)管電壓:1.5 kV，錐孔電壓:40 V，離子源溫度:100℃，脫溶劑氣溫度:250℃，錐孔氣流量:50 L/h，脫溶劑氣流量:60 L/h，碰撞能量(6～40 V)，離子能量:1 V，每0.1 s采集2次圖譜;準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮 氨 酸-腦 啡 肽 (Leucine-enkephalin，ESI+:m/z 556.277 1)溶液為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍:80～1 000 m/z，數(shù)據(jù)采集模式和方式:MSE和Centroid，數(shù)據(jù)分析:MetaboLynxTM軟件。

2.2 樣品處理

2.2.1 對(duì)照品溶液配制 分別精密稱取Z-藁本內(nèi)酯、正丁烯基苯酞、天麻素適量，用70%乙腈溶解配制成濃度分別為42.2、40.7、36.0μg/mL的對(duì)照品溶液，用于UPLC-QTOF/MS分析。另量取Z-藁本內(nèi)酯適量，用食用油溶解，得0.1 g/mL灌胃溶液。

2.2.2 大川芎方樣品制備 取川芎1 000 g，加10倍量水，浸泡3 h，加熱回流提取揮發(fā)油3 h，濾液減壓濃縮至相當(dāng)于1 g生藥，再加乙醇使含醇量為70%，醇沉，靜置 24 h，離心(3 000 r/min，10 min)，上清液減壓濃縮至無(wú)醇味呈稠膏狀，得浸膏Ⅰ。取250 g天麻加入上述川芎藥渣中，加10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味呈稠膏狀，得浸膏Ⅱ。將浸膏Ⅰ、浸膏Ⅱ及揮發(fā)油混合均勻，得大川芎方提取物(每克浸膏相當(dāng)于3.7 g生藥量)。

2.2.3 家兔代謝樣品處理 取家兔6只，分為空白組、Z-藁本內(nèi)酯組和大川芎方組，按人臨床用藥量20倍給家兔灌胃，Z-藁本內(nèi)酯組0.2 g/kg體重，大川芎方組11.667 g生藥/kg體重，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)3 d，每天一次，末次給藥前12 h禁食，不禁水，末次給藥1 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，置肝素試管中，充分混勻，以3 000 r/min離心10 min后取上清液，合并各組血漿。取5 mL血漿加3倍量乙腈，渦旋均勻，13 000 r/min(4℃)離心10 min，取上清液;氮?dú)饬鞔蹈?，?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用于UPLC-QTOF/MS分析。

2.3 MetaboLynxTM數(shù)據(jù)處理的程序設(shè)置

將大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素Ⅰ相、Ⅱ相代謝途徑可能產(chǎn)生的代謝物輸入MetabolynxTM軟件見(jiàn)表1，選用ApexTrack峰整合算法，代謝產(chǎn)物峰面積:>1 pau，質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測(cè)誤差范圍:<5 mDa，并將質(zhì)量虧損過(guò)濾(DMF)應(yīng)用于空白血漿與含藥血漿UPLC-QTOF/MS數(shù)據(jù)的處理。

表1 Ⅰ相及Ⅱ相可能產(chǎn)生的代謝途徑

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC-QTOF/MS分析及數(shù)據(jù)處理

利用UPLC-QTOF/MS及MSE數(shù)據(jù)采集技術(shù)對(duì)空白血漿和給藥血漿進(jìn)行測(cè)定，得出ESI+總離子流圖見(jiàn)圖1，在ESI+下，大川芎方給藥血漿未得到較好的響應(yīng)信號(hào)。通過(guò)MetabolynxTM軟件的質(zhì)量虧損過(guò)濾器(MDF)技術(shù)處理數(shù)據(jù)，得到大川芎方提取物中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物見(jiàn)圖2，各代謝物的生物轉(zhuǎn)化途徑見(jiàn)表2。

3.2 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定

代謝物鑒定的主要依據(jù)是藥物發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化后，一般是在原藥的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分結(jié)構(gòu)修飾，藥物的母體結(jié)構(gòu)一般不會(huì)發(fā)生太大變化，因此代謝物與原藥常有相似的質(zhì)譜特征離子，據(jù)此可對(duì)代謝物進(jìn)行識(shí)別，再結(jié)合其它碎片離子的信息和藥物的生物體內(nèi)代謝規(guī)律，對(duì)代謝物做出合理推斷。

圖1 UPLC-ESI+-QTOF/MS的總離子流圖

表2 大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素代謝物的生物轉(zhuǎn)化

圖2 大川芎方中藁本內(nèi)酯及天麻素的代謝物經(jīng)DMF處理后的色譜圖

3.2.1 原型藥物的識(shí)別與鑒定 M01(TR9.58 min)與M02(TR9.94 min)

由MetabolynxTM軟件處理，給藥血漿ESI+圖中，檢測(cè)到m/z為191［M+H］+但保留時(shí)間分別為9.58 min與9.94 min的2個(gè)質(zhì)譜峰，川芎中存在分子量為190的藁本內(nèi)酯2個(gè)異構(gòu)體。將給藥血漿與Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品離子流圖比較，TR為9.94 min處皆有 m/z 191 峰，MSE圖中皆有 m/z 191、173、163、145、129、115峰，據(jù)此推測(cè)，血漿中 TR為 9.94 min的峰為Z-藁本內(nèi)酯，TR為9.58 min為E-藁本內(nèi)酯，這與文獻(xiàn)［4-6］報(bào)道的使用C18反相色譜柱時(shí)，E-藁本內(nèi)酯出峰較Z-藁本內(nèi)酯出峰早的結(jié)果相一致。

在給藥血漿ESI+圖中未檢測(cè)到天麻素原型m/z287［M+H］+的相應(yīng)信號(hào)，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道相符。

3.2.2 代謝物的識(shí)別與鑒定

3.2.2.1 氧化反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

藥物代謝中的氧化反應(yīng)包括氧化反應(yīng)和脫氫反應(yīng)等，主要是在CYP-450酶系催化下進(jìn)行的反應(yīng)。在CYP-450酶系作用下，長(zhǎng)碳鏈的烷烴常在碳鏈末端甲基上氧化生成羥基，環(huán)二烯己烷易芳香化脫氫生成穩(wěn)定的苯環(huán)結(jié)構(gòu)。同時(shí)也容易發(fā)生去羥甲基化及甲基化反應(yīng)。

M1(TR7.40 min)與M2(TR7.80 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.40 min與7.80 min處存在m/z 207峰的兩個(gè)化合物，一級(jí)MS顯示m/z 207［M+H］+為其分子離子峰，對(duì) m/z 207［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示189［M+H-H2O］+、161［M+H-H2O-CO］+、121［M+H-H2O-CO-C3H4］+、119［M+H-H2O-COC3H6］+的主要碎片離子峰，推測(cè)其為互為順?lè)串悩?gòu)藁本內(nèi)酯羥基化氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，通過(guò)與Z-藁本內(nèi)酯組比較并結(jié)合文獻(xiàn)［8］分析，推斷TR7.40 min的代謝物M1為E-11-羥基藁本內(nèi)酯，TR7.80 min的代謝物M2為Z-11-羥基藁本內(nèi)酯。

M5(TR9.32 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖一級(jí)MS中，9.32 min處存在m/z 189［M+H］+的分子離子峰，對(duì) m/z 189［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示161［M+H-28］+、143的主要碎片 m/z分別比藁本內(nèi)酯的相應(yīng)碎片少2，與正丁烯基苯酞對(duì)照品比較，其色譜及質(zhì)譜行為相一致。Z-藁本內(nèi)酯給藥組圖譜中存在相同的碎片峰，推測(cè)TR9.32 min的代謝物M5為藁本內(nèi)酯脫氫化產(chǎn)物，即芳構(gòu)化轉(zhuǎn)變成正丁烯基苯酞，并與文獻(xiàn)［8］的結(jié)果相符。

M7(TR5.56 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中5.56 min處存在m/z257峰的化合物，一級(jí)MS顯示m/z257［M+H］+為其分子離子峰，對(duì)m/z257［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示 95［M+H-162］+的主要碎片離子峰，推測(cè)TR5.56 min的代謝物M7為天麻素去羥甲基化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

M8(TR5.41 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中5.41 min處存在m/z273峰的化合物，一級(jí)MS顯示m/z273［M+H］+為其分子離子峰，對(duì)m/z273［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示111［M+H-162］+的主要碎片離子峰，推測(cè)TR5.41 min的代謝物M8為天麻素去甲基化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

3.2.2.2 水解反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

水解反應(yīng)是具有酯類藥物在體內(nèi)代謝的主要途徑，在酯酶的催化作用下，代謝生成酸。M3(TR7.11 min)與M4(TR9.58 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.11 min與9.58 min處存在m/z 209峰的兩個(gè)化合物，一級(jí)MS顯示m/z 209［M+H］+為其分子離子峰，對(duì) m/z 209［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示191［M+H-H2O］+、173、163、145 的主要碎片離子峰，與藁本內(nèi)酯對(duì)照品的裂解方式相吻合，推測(cè)M3、M4為互為順?lè)串悩?gòu)藁本內(nèi)酯水解反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，但在Z-藁本內(nèi)酯組未檢測(cè)到這兩個(gè)化合物。

3.2.2.3 氨基酸結(jié)合產(chǎn)物的鑒定

氨基酸結(jié)合反應(yīng)是體內(nèi)許多羧酸類藥物和代謝物的主要結(jié)合反應(yīng)，其中包含有S-半胱氨酸和甘氨酸，是在輔酶A的催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

M6(TR6.48 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖一級(jí)MS中，6.48 min處存在分子離子峰m/z 310［M+H］+的化合物，比原型藥物多119個(gè)質(zhì)量單位，對(duì)m/z 310［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示191［M+H-119］+、175、145 等與藁本內(nèi)酯相同的主要碎片離子峰，并通過(guò)Z-藁本內(nèi)酯組圖譜比較分析，推測(cè)TR6.48 min的代謝物M6為Z-藁本內(nèi)酯S-半胱氨酸結(jié)合反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

M9(TR6.34 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中6.34 min處存在m/z344峰的化合物，一級(jí)MS顯示m/z344［M+H］+為其分子離子峰，對(duì)m/z344［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示 287［M+H-57］+、125的主要碎片離子峰，推測(cè)TR6.34 min的代謝物M9為天麻素甘氨基酸結(jié)合反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

3.2.2.4 乙?；磻?yīng)產(chǎn)物的鑒定

乙?；磻?yīng)是在酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下進(jìn)行的，以乙酰輔酶A作為輔酶，對(duì)羥基進(jìn)行乙?；磻?yīng)。M10(TR7.80 min)

由MetabolynxTM軟件處理得到在家兔血漿ESI+圖中7.80 min處存在m/z329峰的化合物，一級(jí)MS顯示m/z329［M+H］+為其分子離子峰，對(duì)m/z329［M+H］+進(jìn)行 MSE分析，顯示 287［M+H-42］+、125的主要碎片離子峰，推測(cè)M10為天麻素乙?；磻?yīng)的代謝產(chǎn)物。

3.3 討論

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)具有靈敏度高和分析復(fù)雜混合物的能力，獲得被測(cè)物的分子結(jié)構(gòu)信息，從而能夠在沒(méi)有對(duì)照品的情況下對(duì)未知物進(jìn)行定性分析，該方法已成為藥物代謝鑒定的特別技術(shù)［9］。運(yùn)用該技術(shù)不僅可以避免復(fù)雜繁瑣的分離純化代謝物的工作，而且可以分離鑒定難以辨識(shí)的體內(nèi)痕量代謝物。本文使用UPLC-QTOF聯(lián)用技術(shù)，采用MSE操作模式，該模式能迅速地在兩種MS能量間切換，首先獲得低能量譜圖，然后應(yīng)用階梯碰撞能獲取譜圖，應(yīng)用ApexTrack峰整合算法分析所有復(fù)雜樣品信息，包括所有準(zhǔn)分子離子和子離子，只需進(jìn)樣一次，所得的數(shù)據(jù)應(yīng)用質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行代謝產(chǎn)物的篩選和鑒定。質(zhì)量虧損過(guò)濾是一種比較新的數(shù)據(jù)處理技術(shù)，利用母體藥物的精確質(zhì)量數(shù)和它接近的整數(shù)值之間的差異，估計(jì)這些代謝物的分子量范圍和質(zhì)量虧損落在什么區(qū)間，去除落在期望的范圍之外的所有離子，縮小假陽(yáng)性的數(shù)目，提高更可信的結(jié)果［10］。

中藥復(fù)方是中醫(yī)治病的主要臨床應(yīng)用形式，是由多味中藥組成，而各味中藥又由多種成分組成，研究顯示許多中藥復(fù)方的配伍變化會(huì)直接導(dǎo)致體內(nèi)代謝途徑和代謝產(chǎn)物的變化［11］，故某一成分的代謝只是整味中藥或復(fù)方代謝全貌的極小部分，而復(fù)方代謝的全貌不僅是各成分代謝或各味中藥代謝的簡(jiǎn)單疊加和綜合。本研究中，大川芎方給藥組中存在藁本內(nèi)酯水解反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，而在Z-藁本內(nèi)酯給藥組中未檢測(cè)到相應(yīng)的信號(hào)，這可能與復(fù)方中藥效物質(zhì)相互作用有關(guān)。

本研究應(yīng)用MSE與質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)鑒定了大川芎方在家兔血漿中藁本內(nèi)酯及天麻素兩個(gè)主要有效成分的代謝物，藁本內(nèi)酯被檢測(cè)到原型及其氧化、水解反應(yīng)的5個(gè)Ⅰ相代謝產(chǎn)物和1個(gè)半胱氨酸軛合Ⅱ相代謝產(chǎn)物;天麻素原型藥物未出現(xiàn)，共檢測(cè)到氧化與軛合反應(yīng)等4個(gè)代謝產(chǎn)物，為大川芎方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理提供依據(jù)，并有助于大川芎方的合理臨床用藥方案和質(zhì)量控制提供一定的參考。

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