莫小路， 朱慶玲， 陳瑜珍， 嚴(yán) 振

(廣東省中藥研究所，廣東廣州510520)

植物精油也稱揮發(fā)油，大多有芳香味，廣泛用于香料、香水化妝品工業(yè);許多研究報(bào)道植物精油還具有強(qiáng)烈的抑制植物病原真菌、人體致病菌和真菌等微生物的作用［1-3］;本文作者研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油和數(shù)種植物精油配合使用對(duì)多種植物病原菌的殺菌效果更強(qiáng)［4］。由于植物精油來源于植物，而且易揮發(fā)，作為外用殺菌藥物，具有較好的安全性。為進(jìn)一步了解植物精油對(duì)常見病原微生物的抑菌效果，本文對(duì)肉桂精油等5種植物精油及其混合物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)研究，為精油抗菌藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試精油

肉桂精油、香茅精油、廣藿香精油、丁香羅勒精油、紫蘇精油為本實(shí)驗(yàn)室自制，參照要《中國(guó)藥典》(2005版)附錄ⅩD操作方法從原植物中提取。

1.2 供試菌種

大腸桿菌(Escherichia coli);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus);普通變形桿菌(Proteus vulgaris);金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis);糞腸球菌(Enterococcus faecalis);藤黃微球菌(Micrococcus luteus);粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)為本所微生物實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種。

1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、麥芽瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 儀器設(shè)備

Thermo超凈工作臺(tái)、MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 供試菌液準(zhǔn)備

細(xì)菌菌液:用接種環(huán)從培養(yǎng)24 h的供試菌斜面培養(yǎng)基上挑取菌落一環(huán)，接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃震蕩培養(yǎng)24 h后，用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋至含菌量為104～105cfu/mL的菌懸液(以平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定)，備用。

1.5.2 供試精油的制備

參照文獻(xiàn)方法［5］，供試精油分別與10倍體積的滅菌10%吐溫-80生理鹽水混合后，再用滅菌生理鹽水稀釋到各濃度，備用。復(fù)合精油按設(shè)計(jì)的組合將不同的精油混勻后，再以同法稀釋備用。

1.5.3 平板打孔法抑菌試驗(yàn)［6］

100 μL稀釋菌液與15 mL的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合后，靜置冷凝。用無菌打孔器在瓊脂平板上打上直徑為6 mm的孔5個(gè)，每孔之間距離25 mm以上，挑出孔內(nèi)瓊脂培養(yǎng)基，將不同濃度的供試精油稀釋液滴入孔內(nèi)(每孔20μL)，陰性對(duì)照滴加20μL 10%的吐溫-80生理鹽水稀釋液，陽性對(duì)照滴加20μL卡那霉素生理鹽水溶液(100 mg/mL)。置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后，取出平板，測(cè)量各孔抑菌圈直徑。

1.5.4 最小抑菌濃度(Minimal Inhibition Concentration，MIC)的測(cè)定

采用二倍稀釋法對(duì)供試精油進(jìn)行梯度稀釋，在各稀釋管中加入100μL濃度為104～105cfu/ml的菌懸液，混勻，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后，每管吸取100μL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)20～24 h，以平板供試菌無菌落生成的最低精油濃度的供試精油對(duì)該菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一精油的抑菌作用

本試驗(yàn)測(cè)定了0.05 mg/mL和0.1 mg/mL兩個(gè)濃度的精油-吐溫80-生理鹽水溶液對(duì)9種供試菌的抑菌圈，當(dāng)精油濃度為0.05 mg/mL時(shí)，除了肉桂精油外，其余精油對(duì)大部分供試菌都沒有抑制作用，而精油濃度為0.1 mg/mL時(shí)，5種精油都對(duì)供試菌都有一定的抑制作用(見表1)。其中，肉桂精油的抑菌作用最強(qiáng)，且抑菌譜廣，對(duì)所有的供試菌都有抑制作用;而紫蘇精油的抑菌作用最弱;丁香羅勒精油、廣藿香精油和香茅精油對(duì)供試的革蘭氏陽性菌有不同程度的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌沒有抑制作用。

表1 單一精油的抑菌效果

2.2 復(fù)合精油的抑菌作用

根據(jù)單一精油的抑菌結(jié)果，按表2設(shè)計(jì)3組復(fù)合精油組合，每組中的精油組分以等量混合(混合后的精油溶液濃度為0.1 mg/mL)。各組復(fù)合精油的抑菌效果見表3，各組復(fù)合精油的抑菌效果與單一精油相比，都有明顯提高，僅對(duì)普通變形桿菌的抑菌作用較弱。其中，Ⅰ和Ⅱ組的抑菌效果相近，而Ⅲ組的抑菌強(qiáng)度稍弱。

表2 不同復(fù)合精油的組成

2.3 復(fù)合精油的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

由表4可見，3組復(fù)合精油的最小抑菌濃度(MIC)中，復(fù)合精油Ⅱ?qū)┰嚲N的MIC值最低，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌，其MIC值僅為6.25 ug/mL，因此，從產(chǎn)品研發(fā)的角度來說，由肉桂精油、香茅精油和廣藿香精油組成的復(fù)合精油Ⅱ具有更好的開發(fā)前景。

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)研究的5種植物精油中，肉桂精油的抑菌效果最好，且抑菌譜較寬，對(duì)所以供試菌都有抑制。精油是單萜或倍半萜化合物，其組成成分非常復(fù)雜，精油往往比其中分離到的單體具有較寬的抗菌譜。從藥物開發(fā)的角度考慮，我們選取了幾種精油組合進(jìn)行抗菌作用的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了所試的3個(gè)復(fù)合精油抑制的病原菌種類都比單一化合物的要多，并且抑菌效果都明顯提高。本研究的結(jié)果顯示了，選用的肉桂、香茅和廣藿香3種植物精油等量配合而成的復(fù)合精油Ⅱ具有較好的殺菌藥物開發(fā)前景。

表3 復(fù)合精油的抑菌效果

表4 復(fù)合精油Ⅲ的最小抑菌濃度(M IC)的測(cè)定

［1］莫小路，嚴(yán) 振，王玉生，等.廣藿香精油對(duì)植物病原真菌的抑菌活性研究［J］.中藥材，2004，27(11):

［2］王發(fā)松，楊得波，任三香，等.香葉樹果揮發(fā)油的化學(xué)成分和抗菌活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，11(6):1-4.

［3］郭群群，杜桂彩，李榮貴，等.紫蘇葉揮發(fā)油抗菌活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2003;24(9):25.

［4］嚴(yán) 振，莫小路，曾慶錢，等.一種植物源天然殺菌劑:中國(guó)，200810215887.0［P］.2009-3-18.

［5］張國(guó)珍，樊 瑛，丁萬隆，等.麻黃和細(xì)辛揮發(fā)油的抗真菌作用［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1995，22(4):373-374.

［6］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:216.