段彥蒼， 杜惠蘭， 靳亞慈

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050091)

乳腺增生病隸屬于中醫(yī)學(xué)的“乳中結(jié)核”、“乳疬”等范疇。乳腺增生病在病理方面除了表現(xiàn)在上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、腺泡、導(dǎo)管等組織的增生外，亦存在著血管的增生［1］。目前血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生成因子(bFGF)被認(rèn)為是乳腺癌特異性最強的兩種血管因子。我們推測乳腺增生中血管的生成可能與VEGF和bFGF密切相關(guān)。因此我們采用肌注外源性激素的方法復(fù)制乳腺增生大鼠模型，應(yīng)用放免和免疫組織化學(xué)技術(shù)探討乳腺增生病變與血清、乳腺VEGF和bFGF的關(guān)系以及針?biāo)巺f(xié)同作用對血清、乳腺VEGF和bFGF的調(diào)節(jié)治療機制。

材料和方法

1 動物

選用健康清潔級♀性Wistar大鼠60只，75～85日齡，體重(220±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供，合格證號:602089。

2 藥物和試驗試劑

試驗所用中藥(柴胡、郁金、赤芍、白芍、川楝子、丹參、丹皮、橘核、王不留行、夏枯草、牡蠣、荔枝核、山慈菇)采用傳統(tǒng)的煎煮方法，過濾，離心，濃縮制成水煎液，每毫升約含生藥2.75 g，密封分裝，4℃放置備用。

苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液均由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。枸櫞酸他莫昔芬由上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)。

VEGF和bFGF酶聯(lián)免疫試劑盒，購于美國R-D公司。E2、P放免試劑盒購于美國DSL公司。PRL放免試劑盒購于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

3 試驗方法

3.1 動物分組

綜上所述，Hp陰性萎縮性胃炎患者應(yīng)用替普瑞酮治療的臨床效果更加顯著，不僅可以減輕胃黏膜病變程度，改善臨床癥狀，還可以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機數(shù)字表法將其分為6組，每組10只:即正常組、模型組、模型+針刺組(簡稱“針刺組”)、模型+中藥組(簡稱“中藥組”)、模型+針刺+中藥組(簡稱“針?biāo)幗M”)、模型+TAM陽性對照組(簡稱“對照組”)。

3.2 復(fù)制模型

除正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)外，其余組參照張璐［2］等造模方法，大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg/d)，連續(xù)25 d，然后注射黃體酮5 mg/(kg/d)，連續(xù)5 d，建立大鼠乳腺增生模型。

3.3 治療方法

從第31天開始，各組分別治療。針刺組:根據(jù)《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》結(jié)合人體穴位，選取屋翳、合谷、膻中、足三里，每日1次，9次為一療程，療程間休息1 d，共30 d。中藥組:按25g/(kg/d)灌服中藥，30 d。針?biāo)幗M:針刺操作同針刺組，同時灌服中藥，劑量同中藥組，30 d。對照組:TAM 1.9 mg/(kg/d)，相當(dāng)于臨床等效劑量，30 d。正常組和模型組灌服同體積蒸餾水，30 d。

4 標(biāo)本制備和檢測方法

末次治療5 h后，用游標(biāo)卡尺測量第2對乳房的直徑。斷頭取血，制備血清，置－70℃保存，用放射免疫法測定血清E2、P和PRL含量，酶聯(lián)免疫法測定血清VEGF和bFGF含量。切取第2對乳房，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片(4 μm)，免疫組織化學(xué)染色(按ABC試劑盒操作指南進(jìn)行)。

美國IPP(Image-proplus)分析軟件對免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析，每個切片采集5個視野，得出度量物質(zhì)含量信息的灰度等級，將所得灰度值取平均數(shù)作為統(tǒng)計指標(biāo)。平均灰度與陽性表達(dá)強弱成反比，灰度值越小，陽性染色越強，蛋白表達(dá)越多。

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析，檢驗以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 大鼠乳頭直徑的變化(見表1)

乳腺增生模型組大鼠的乳頭豎起，較堅實，充血，增高2～3 mm。正常組的乳頭形態(tài)與試驗開始時一樣，隔毛看不見乳頭位置，將毛分開后，僅見乳頭呈小米樣，緊貼在皮膚上，蒼白、柔軟、個別稍隆起1 mm左右。針刺組、中藥組、對照組和針?biāo)幗M乳頭直徑均減小，其中對照組和針?biāo)幗M乳頭直徑明顯減小，與模型組相比有顯著性差異。

表1 各組大鼠乳頭的直徑變化比較(±s)

表1 各組大鼠乳頭的直徑變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數(shù)/只 乳頭直徑/μm正常組10 1.085±0.064模型組 10 1.311±0.063**針刺組 10 1.251±0.038**Δ中藥組 10 1.253±0.055**Δ針?biāo)幗M 10 1.186±0.051**ΔΔ對照組 10 1.215±0.032**ΔΔ

2 血清生殖激素變化(見表2)

治療后與模型組相比，針刺組和中藥組大鼠血清E2水平降低(P<0.05)，針?biāo)幗M和對照組大鼠血清E2水平明顯降低(P<0.01);針?biāo)幗M血清 PRL含量水平降低(P<0.05);針?biāo)幗M血清中P的含量升高(P<0.01)，和正常組無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 各組大鼠血清E2、P、PRL變化比較(±s)

表2 各組大鼠血清E2、P、PRL變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數(shù)/只 E2/(pg/mL) P/(ng/mL) PRL/(ng/mL)正常組10 15.238±8.218 57.047±17.014 7.947±1.459模型組 10 36.864±20.599**31.571±5.821** 9.912±4.206*針刺組 10 22.974±12.067Δ 43.492±18.742 8.349±1.202中藥組 10 21.191±16.587Δ 45.362±20.310 8.363±1.049針?biāo)幗M 10 15.759±10.912ΔΔ 55.311±18.727ΔΔ 7.987±1.188Δ對照組 10 19.257±13.439ΔΔ35.402±14.929**8.217±0.735

3 血清VEGF、bFGF的變化(見表3)

與正常組相比，模型組大鼠血清中VEGF和bFGF的含量明顯升高，其它組含量均降低，尤其針?biāo)幗M降低明顯(P<0.01)。

表3 各組大鼠血清VEGF、bFGF的變化比較(±s)

表3 各組大鼠血清VEGF、bFGF的變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數(shù)/只 VEGF/(pg/mL) bFGF/(pg/mL)正常組10 16.414±3.798 244.370±57.431模型組 10 21.357±4.816** 507.900±79.051**針刺組 10 20.114±5.501* 446.375±73.120**中藥組 10 18.117±2.735 444.440±65.137**Δ針?biāo)幗M 10 15.400±2.285ΔΔ 406.350±55.675**ΔΔ對照組 10 17.239±2.978Δ 264.010±78.394ΔΔ

4 乳腺組織VEGF、bFGF的表達(dá)

VEGF、bFGF的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，為棕黃色染色。與正常組相比，模型組大鼠乳腺組織中VEGF、bFGF的表達(dá)增強(P<0.01)。治療后，針刺組、中藥組和針?biāo)幗MVEGF、bFGF的表達(dá)均明顯低于模型組(均P<0.01);對照組與模型組比較有降低的趨勢，但兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(表 4、圖 1，2)

表4 各組大鼠VEGF、bFGF表達(dá)平均灰度比較(±s)

表4 各組大鼠VEGF、bFGF表達(dá)平均灰度比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05;**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數(shù)/只VEGF bFGF正常組10 84.76±8.30 102.00±4.90模型組 10 62.89±8.05** 77.61±5.08**針刺組 10 71.09±6.28**ΔΔ 86.24±3.30**ΔΔ中藥組 10 75.13±2.80**ΔΔ 87.29±5.24**ΔΔ針?biāo)幗M 10 88.25±6.57ΔΔ 100.05±8.42ΔΔ對照組 10 64.96±7.24** 80.45±4.95**

討論

乳腺增生是女性常見病，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳腺增生病的發(fā)生與內(nèi)分泌紊亂、卵巢功能失調(diào)造成體內(nèi)長時間的P不足、E2絕對或相對增多有關(guān)。乳腺增生病被認(rèn)為是乳腺癌癌前的一種良性病變，血管增生在乳腺腫瘤的生長過程中起到了重要作用。VEGF在健康成人組織中維持正常的血管密度和基本的滲透功能，以利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，但表達(dá)水平極低，是機體內(nèi)皮細(xì)胞特異性的分裂原和血管增生因子，對血管生成和血管通透性增加有重要的調(diào)節(jié)功能［3］。VEGF通過刺激血管新生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，是目前所知的作用最強，選擇性最高的內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原，是腫瘤血管生成過程中的重要調(diào)節(jié)因子［4］。VEGF及其受體通過旁分泌途徑聯(lián)合調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化、血管生成［5］;又通過自分泌調(diào)節(jié)功能協(xié)調(diào)其功能的完成。在血管形成的調(diào)控中，bFGF起著關(guān)鍵作用。bFGF能促進(jìn)表皮、內(nèi)皮細(xì)胞再生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)其從基膜中分離出來，以刺激內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織趨化運動，并形成管狀結(jié)構(gòu)，還可提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子類(PAs)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他蛋白酶，是血管形成較為直接的誘導(dǎo)物質(zhì)。bFGF亦能通過自分泌和旁分泌形式促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移［6］。

圖1 VEGF在各組乳腺的表達(dá)(×200)

圖2 bFGF在各組乳腺的表達(dá)(×200)

在乳腺增生模型大鼠的血清中，存在著VEGF和bFGF的高含量，在局部組織中存在著VEGF和bFGF的高表達(dá)，我們認(rèn)為在乳腺增生模型大鼠中存在著血管增生，乳房局部已經(jīng)存在微循環(huán)障礙。VEGF和bFGF可能通過一定的途徑被激活后，通過某種共同的機制促使乳腺組織局部的增生。針?biāo)幗Y(jié)合可能通過下調(diào)VEGF和bFGF，減少病變區(qū)域的血流信號，加快血流速度，以改善乳腺組織的微循環(huán)、改變?nèi)橄俳M織的血管數(shù)目和形狀，從而達(dá)到治療目的。同時提示我們針?biāo)幗Y(jié)合的治療方法，與單純服用中藥、單純應(yīng)用針灸以及西藥三苯氧胺(TAM)相比較，療效顯著，作用廣泛。這為中醫(yī)藥干預(yù)治療乳腺增生病提供了實驗依據(jù)。

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