侯麗波，佟 巍，謝軍芳，喬紅偉，叢 喆，蔣 虹，王 衛(wèi)，魏 強

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型標(biāo)準(zhǔn)化血清制備及ELISA檢測方法的建立

侯麗波，佟 巍，謝軍芳，喬紅偉，叢 喆，蔣 虹，王 衛(wèi)，魏 強

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

目的 制備標(biāo)準(zhǔn)化小鼠呼腸孤病毒 III型(reovirus 3，Reo－3)免疫血清，建立小鼠 Reo－3抗體 ELISA檢測方法。方法 使用動物來源的Reo－3病毒感染BALB/c小鼠，獲得高效價免疫血清;以 BHK－21細(xì)胞制備Reo－3病毒抗原，同時制備做正常對照抗原。滴定抗原和標(biāo)準(zhǔn)化小鼠Reo－3血清的最佳工作濃度，進行特異性、敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等實驗。結(jié)果 制備18mL抗Reo－3血清，經(jīng)檢測，IFA效價達(dá)1∶640，IEA效價達(dá)1∶160;Reo－3抗原和標(biāo)準(zhǔn)化小鼠 Reo－3免疫血清最佳工作濃度分別為5 μg/mL和1∶2400;該ELISA檢測體系 Reo－3特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)為3.8%，批間變異系數(shù)為4.0%;檢測靈敏度＞1∶4400;與仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)、小鼠多瘤病毒(POLY)均無交叉反應(yīng)。經(jīng)37℃破壞性試驗，2 d穩(wěn)定性試驗相對偏差＜27%。結(jié)論 本研究制備的Reo－3抗血清達(dá)到同批次大量高滴度的水平，可作為檢測實驗小鼠Reo－3病原的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。本研究建立的ELISA方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，特異性、敏感性強。該體系可用于大、小鼠等實驗動物Reo－3抗體的檢測。

呼腸孤病毒Ⅲ;標(biāo)準(zhǔn)化;血清;ELISA

呼腸病毒 III型(Reovirus 3，Reo－3)屬于呼腸病毒科的正呼腸病毒屬。該病毒能感染所有哺乳動物，在嚙齒類動物群體中多呈隱性感染。有報道稱該病毒在實驗小鼠的8種病毒中占第二位［1］，病毒污染鼠群會干擾腫瘤移植，并且 Reo－3能引起乳鼠的多種系統(tǒng)性疾病，包括壞死性肝炎、心肌炎、胰腺炎以及腦膜炎等疾?。?］。Reo－3在動物群體中通過空氣和糞－口途徑傳播，并且有人認(rèn)為 Reo－3在環(huán)境中能穩(wěn)定生存是造成病毒污染的主要原因［3］。因而Reo－3是國標(biāo)要求SPF級實驗小鼠必檢的項目之一。定期抽樣檢測是預(yù)防和控制鼠群中Reo－3感染的重要手段，本實驗旨在制備標(biāo)準(zhǔn)化Reo－3陽性血清并建立ELISA檢測方法，解決質(zhì)控血清小批次不規(guī)范等問題，并在此基礎(chǔ)上進一步完善ELISA檢測方法，豐富同類檢測資源。為其他多種病毒血清學(xué)方面的標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測提供模式，以期在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)實驗動物檢測水平的進一步提高。

1 材料和方法

1.1 材料

Reo－3 病毒、BHK－21 細(xì)胞，引自 ATCC，本實驗室保藏;3日齡SPF級ICR小鼠，6～8周齡，雄性SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCKK(京)2007－0001］。

1.2 主要試劑

羊抗小鼠抗體 protein A－peroxidase，Staphylococcusaureus/horseradish(Sigma公司，P8651);山 羊 抗 小 鼠 FITC－抗 體:fluorescein conjugated IgG fraction goat anti－mouse(Cappel公司，Cat.No.1211－0081);BCA蛋白測定試劑盒(Peirce公司);TMB底物購自濟南泰天和生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Reo－3病毒免疫血清的制備:

1.3.1.1 免疫病毒抗原的制備:Reo－3感染 BHK－21細(xì)胞CPE達(dá)“+++～++++”時，反復(fù)凍融3次后，低速除去細(xì)胞碎片。取上清液經(jīng)1∶100稀釋后，以腦內(nèi)注射的方式感染3日齡SPF級ICR乳鼠(帶母)，30 μL/只。7～10 d后，無菌操作收取乳鼠內(nèi)臟，按1∶10(g/mL)重量體積比加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。充分研磨后，組織懸液離心12 000 r/min，30 min，收取上清液。并取少量感染BHK－21細(xì)胞，根據(jù)Reed－Muench法測TCID［4］50

1.3.1.2 Reo－3 病毒陽性血清制備:Reo－3 組織毒感染 BALB/c 小鼠，100 TCID50/200 μL/只，分別于0、7、14 d腹腔注射，最后一次免疫后第10天，尾尖采血，56℃ 30 min滅活后測定抗體效價［5］。IFA效價達(dá)1∶640，乙醚麻醉后，摘眼球采血。全血靜置4 h 后，離心 3 000 r/min，20 min，收集血清。

1.3.1.3 血清效價的初步鑒定［6，7］:取 Reo－3 陽性血清，自1∶10開始，對倍稀釋后，用 IFA、IEA法進行效價滴定。同時用本室制備的仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)、小鼠多瘤病毒(POLY)進行檢測，確定其特異性。

1.3.2 ELISA方法的建立及初步應(yīng)用比較［8］:

1.3.2.1 Reo－3抗原制備及小鼠質(zhì)控血清最佳工作濃度的確定:Reo－3感染 BHK－21細(xì)胞 CPE達(dá)“+++～++++”時，反復(fù)凍融3次后，低速離心除去細(xì)胞碎片，上清再經(jīng)超速離心后，收集沉淀于適量PBS中，即為 ELISA抗原。Reo－3抗原用包被液稀釋成 10 、7.5、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL 6 個濃度，每個濃度平行包被兩孔，制備的Reo－3陽性血清自1∶200開始，對倍梯度稀釋。同時做陰性血清和Reo－3陽性血清對正?？乖膶φ铡RP－SPA經(jīng)滴定做 1∶10 000稀釋，按常規(guī) ELISA反應(yīng)，重復(fù) 3次［9］。

1.3.2.3 特異性交叉試驗:用建立的 ELISA方法在同一條件下對小鼠仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)和小鼠多瘤病毒(POLY)等陽性血清進行特異性交叉試驗，同時設(shè)已知陽性、陰性和空白對照。

1.3.2.4 重復(fù)性試驗:分別取2塊同一批次和不同批次包被的 ELISA板，檢測已知陽性 Reo－3小鼠血清，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，在同一批次 ELISA板上進行批內(nèi)重復(fù)，不同批次的ELISA板之間進行批間重復(fù)，觀察兩者差異。

1.3.2.5 敏感性的確定:用建立的ELISA方法，制備的Reo－3血清自1∶200開始作梯度稀釋，最大稀釋度至1∶4400。按常規(guī)ELISA反應(yīng)，測定本方法的敏感性，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.6 穩(wěn)定性試驗:將Reo－3抗原包被的酶標(biāo)板用封閉液封閉后拍干，按200 μL/孔加酶穩(wěn)定劑 M，作用5 min后拍干，置37℃進行加速破壞性保存實驗［10］。每隔24 h取酶標(biāo)板，以常規(guī)方法進行ELISA測定。每次實驗同時取同批次4℃保存的Reo－3抗原包被的酶標(biāo)板進行實驗。

1.3.2.7 初步應(yīng)用及比較:使用所建立的 ELISA方法對送檢小鼠血清進行 Reo－3檢測，共計檢測30份樣本，其中SPF級小鼠血清10份，清潔級小鼠血清10份，背景不確定小鼠血清10份。同時，用本室IEA，IFA檢測試劑盒做同等檢測，比較檢出率。

2 結(jié)果

2.1 Reo-3感染BHK-21產(chǎn)生CPE

用 Reo－3 病毒感染 BHK－21 細(xì)胞，72 h 后，鏡下CPE達(dá)“++～++++”。病變細(xì)胞形態(tài)固縮，成團(圖1，見彩插)。

2.2 Reo-3感染BHK-21測定TCID50

Reo－3病毒組織懸液，經(jīng) Reed－Muench法測定，TCID50為0.05mL 103.5倍稀釋的病毒液，即該病毒3160倍稀釋液0.05mL等于一個TCID50。

2.3 IFA、IEA鑒定病毒免疫血清

本實驗共收集小鼠 Reo－3陽性血清18mL。經(jīng)IFA檢測，效價達(dá)到1∶640，陽性細(xì)胞呈綠色熒光著色。IEA檢測，效價達(dá)到1∶160，陽性細(xì)胞呈棕色著色，正常細(xì)胞無色(圖2，見封三)。Reo－3免疫血清與 SV、MHV、Mad、TMEV和 POLY無特異性反應(yīng)。

2.4 Reo-3抗原及小鼠標(biāo)準(zhǔn)血清最佳工作濃度的確定

Reo－3 抗原最佳工作濃度為 5 μg/mL;Reo－3 陽性標(biāo)準(zhǔn)血清作1∶2400稀釋時，A值在1.0左右，為避免血清存放原因?qū)е驴贵w滴度下降，將Reo－3陽性標(biāo)準(zhǔn)血清工作濃度定為1∶2000(圖3)。

圖3 ELISA方陣滴定確定Reo－3抗原最佳工作濃度Fig.3 The optimal effective dose of Reo－3－Ag detected by indirect ELISA

2.5 特異性試驗

在Reo－3陰、陽性對照均成立的條件下，與 SV、MHV、Mad、TMEV和POLY陽性血清均無特異性反應(yīng)。

2.6 敏感性的確定

將所制備的 Reo－3標(biāo)準(zhǔn)化血清(IFA效價 1∶640)自 1∶200 開始稀釋，梯度分別為 1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000、1∶2400、1∶2800、1∶3200、1∶3600、1∶4000、1∶4400，按所建立的間接ELISA方法對每個稀釋度進行測定，結(jié)果顯示免疫熒光效價為1∶640的Reo－3標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋至1∶4400后，其 A值為0.662，仍高于陽性范圍，其敏感性比免疫熒光試驗要高出6倍以上(表1)。

表1 Reo－3標(biāo)準(zhǔn)化血清間接ELISA效價測定結(jié)果Tab.1 Titers of standard Reo－3 sera detected by indirect ELISA

2.7 重復(fù)性

經(jīng)檢測，Reo－3特異性抗原批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為3.8%;批間變異系數(shù)(CV)為4.0%。

2.8 穩(wěn)定性

將Reo－3標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋成不同濃度，用同一批次檢測體系檢測，于37℃放置2 d時A值與0 d A值相對偏差在27%以內(nèi)。

2.9 初步應(yīng)用及比對

用本實驗室IEA、IFA［11］檢測試劑盒和本實驗建立的ELISA檢測方法同時檢測30份送檢血清樣品，共檢出Reo－3陽性樣本9例，1例因特異抗原顯色與正?？乖瓕φ諢o顯著差異判為可疑(表2)。

表2 IEA、IFA和ELISA法檢測血清的結(jié)果比較Tab.2 Comparison of detection results by IEA，IFA and ELISA

3 討論

Reo－3病毒在鼠群中常呈隱性感染，威脅實驗動物的健康，進而影響動物實驗的可靠性和準(zhǔn)確性。因此Reo－3是SPF級大小鼠必檢的項目之一。

實驗動物微生物感染監(jiān)測能力和檢測技術(shù)水平的提升，主要體現(xiàn)在檢測診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化方面。檢測用試劑的標(biāo)準(zhǔn)化對檢測質(zhì)量有極大的影響，對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性起著決定性作用。怎樣使檢測方法、技術(shù)達(dá)到統(tǒng)一、規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化的要求，在保證研究成果的可靠性和科學(xué)性方面具有非常重要的意義。在這方面，歐美等發(fā)達(dá)國家已研制出了系列化、商品化的高質(zhì)量檢測試劑盒。

本研究在本室早期IEA、IFA檢測試劑盒研究的基礎(chǔ)上，從病毒標(biāo)準(zhǔn)化血清的制備著手，進行Reo－3標(biāo)準(zhǔn)化血清學(xué)診斷的研究，為的是進一步優(yōu)化現(xiàn)有的實驗條件，在同一個實驗平臺建立穩(wěn)定、可靠的檢測體系，為保證實驗動物質(zhì)量做更多的努力。

3.1 Reo-3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制備

制備標(biāo)準(zhǔn)陽性血清時，用細(xì)胞來源的病毒感染動物，制備組織來源的病毒懸液作為抗原。最大程度上消除多價血清中含有抗細(xì)胞成分的抗體，避免了IFA、IEA檢測中出現(xiàn)正常細(xì)胞抗原本底高的現(xiàn)象。由于感染新生乳鼠產(chǎn)生急性癥狀并死亡，本實驗采用CPE達(dá)“+++～++++”的細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)適當(dāng)稀釋后感染乳鼠，嚴(yán)格監(jiān)視臨床癥狀，在感染后7 d發(fā)現(xiàn)有死亡乳鼠，及時采集小鼠感染臟器，制備組織來源病毒。

本研究制備了18mL Reo－3多價血清。制備血清選用SPF級BALB/c小鼠，并嚴(yán)格按照既定程序進行感染、檢測抗體消長和效價。通過IEA，IFA方法檢測，該抗血清都能達(dá)到效價高(IEA 1∶160;IFA 1∶640)，與多種小鼠病毒無交叉反應(yīng)，靈敏度高。達(dá)到了制備量大，同批次，同條件，高滴度的水平，適于作為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。

3.2 Reo-3 ELISA檢測體系的建立和優(yōu)化

本研究中建立了 Reo－3抗體的 ELISA檢測方法，通過特異性交叉試驗驗證，包被的病毒抗原特異性好，與 SV、MHV、Mad、TMEV 和 POLY 陽性血清均無特異性反應(yīng)，靈敏度高。通過重復(fù)性實驗證明，本研究所建立的ELISA檢測方法，批內(nèi)變異系數(shù)為3.8%;批間變異系數(shù)為4.0%。重復(fù)性良好。

在ELISA試劑穩(wěn)定性檢測中，采用37℃度破壞性保存實驗。在破壞性保護實驗中，37℃放置1 d相當(dāng)于4℃保存1.5個月［12］。本實驗結(jié)果顯示，所建ELISA檢測體系各成分在37℃放置1 d后，與0 d比較，相對偏差為2.9% ～15.9%，而2 d后相對偏差在27%以內(nèi)，在30%的范圍，所以認(rèn)為所建立的ELISA體系4℃條件下能保持3個月穩(wěn)定。

檢測結(jié)果的差異出現(xiàn)在背景不確定小鼠血清上。對出現(xiàn)差異的1份可疑樣本，用本實驗室成熟的IFA方法對這1例可疑血清進行復(fù)檢，結(jié)果為陽性，與本課題所建ELISA方法檢測結(jié)果一致。說明本課題所建ELISA方法可用于大批量樣品的篩查，對可疑結(jié)果可用IFA進行復(fù)檢。但本實驗建立的ELISA試劑盒，需進一步經(jīng)過條件優(yōu)化，才能作為ELISA檢測試劑盒提供使用。

目前，免疫熒光(IFA)、免疫酶(IEA)、ELISA等均為國際通用的實驗動物病毒特異性抗體的檢測方法。本研究在建立標(biāo)準(zhǔn)化ELISA檢測體系的過程中，用IFA和IEA方法檢定病毒的抗血清效價，同時輔助ELISA體系對可疑血清進行復(fù)檢，從而保證檢測結(jié)果的可靠性。IFA和IEA檢測體系是本實驗室建立的成熟的檢測平臺，在此基礎(chǔ)上，本研究再建立穩(wěn)定靈敏的ELISA方法，實現(xiàn)在同一個實驗室對同一種病毒進行不同方法的檢測，提高檢測結(jié)果的可信度和精確性，搭建更為完善的檢測平臺。

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［6］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，實驗動物 微生物學(xué)檢測方法(3)［S］.GB/T 14926.52－2001.

［7］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，實驗動物 微生物學(xué)檢測方法(3)［S］.GB/T 14926.51－2001.

［8］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，實驗動物 微生物學(xué)檢測方法(3)［S］.GB/T 14926.50－2001.

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Preparation of Antisera and Establishment of an ELISA Detection Technique for Reovirus III in Laboratory Mice

HOU Li－bo，TONG Wei，XIE Jun－fang，QIAO Hong－wei，CONG Zhe，JIANG Hong，WANG Wei，WEI Qiang
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Comparative Medical Center，Peking union Medical College;Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To prepare a high－titer standard mouse serum against reovirus 3 for quality control of viral infection in laboratory mice and to establish an ELISA method for detecting Reo－3 antibody.Methods BALB/c Mice were infected with Reo－3.Sera were harvested and identified by IFA，IEA.The Reo－3 specific antigen was prepared by raising BHK－21 cells.Results The titers of mouse anti－Reo－3 sera were 1∶640 by IFA and 1∶160 by IEA，respectively.The best working density of Reo－3 antigen and the mouse anti－Reo－3 serum were 5 μg/mL and 1∶2400，respectively.The inter－assay coefficient of variation of normal antigen and specicic antigen was 3.8%.The intra－assay average coefficient of variation was 4.0%.The detection sensitivity was 1∶4400.There was no cross－reactivity with Sendai virus(SV)，mouse hepatitisvirus(MHV)，mouse adenovirus(MAd)，vaccinia virus and mouse polyoma virus(POLY).The stability test showed that the relative deviation was below 27%within 2 days at 37℃ .Conclusion An anti－Reo－3 serum from immunized mice has been prepared.It is with a high titer，sensitive and specific to Reo－3 detection.It can be widely used as a standard control serum to detect Reo－3 serologically.The ELISA method can be used in detecting the Reo－3 antibody in rodent colony with good reproducibility，duplication，stability，specificity，and sensitivity，

Reovirus 3;Standardization;Sera;ELISA;Mouse

R373

A

1671－7856(2010)08－0060－05

2010－1－22

注：A：正常BHK-21細(xì)胞形態(tài)；B：感染Reo-3的BHK-21細(xì)胞固縮，成團。
圖1 BHK-21細(xì)胞感染Reo-3前后形態(tài)比較
Note: A: Normal BHK-21 cells; B: BHK-21 cells infected With Reovirus III.
Fig.1 BHK-21 cells before and after being infected With Reovirus III

注：A：正常 BHK-21細(xì)胞涂片（IFA）；B：Reo-3 感染后的 IFA BHK-21 細(xì)胞涂片（IFA）（1：640）；C：正常 BHK-21 細(xì)胞涂片（IEA）； D：Reo-3 感染后的 IFA BHK-21 細(xì)胞涂片（IEA）（1：160）。
圖2 使用BHK-21細(xì)胞涂片，IFA和IEA方法檢定Reo-3多價血清滴度
Note: A， C: Negative control; B: Detected With anti-Reo-3 serum by IFA; D: Detected With anti-Reo-3 serum by IEA.
Fig.2 Titration of the anti-Reo-3 sera from mice by IFA and IEA

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(DWS 200708);科技部條件基礎(chǔ)平臺專項重點項目(2003DIA7J033);科技部基礎(chǔ)專項重點項目(2002DEA20023)。

侯麗波(1978－)，女，碩士生，從事病毒免疫學(xué)研究工作。

喬紅偉，副研究員，研究方向:實驗動物病毒學(xué)。E－mail:q_hw2004@yahoo.com.cn