王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，高正琴，岳秉飛，賀爭鳴

(中國藥品生物制品檢定所，國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心，北京 100050)

乙型腦炎病毒(JEV)ELISA檢測方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，高正琴，岳秉飛，賀爭鳴

(中國藥品生物制品檢定所，國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心，北京 100050)

目的 建立豬乙型腦炎病毒(JEV)抗體ELISA檢測方法。方法 培養(yǎng)BHK21細胞，接種JEV病毒，制備BHK21正?？乖蚃EV特異抗原，滴定酶結(jié)合物和抗原最佳工作濃度，并進行精密性、敏感性、穩(wěn)定性、特異性實驗。結(jié)果 正常、特異抗原和酶結(jié)合物最佳工作濃度分別為0.2 μg/mL、10 μg/mL和1∶20000;正常、特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.3%和6.4%，批間平均變異系數(shù)分別為9.7%和11.5%;檢測靈敏度為1∶1280;與豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)均無交叉反應。穩(wěn)定性試驗相對偏差小于25%。結(jié)論 建立的ELISA方法重復性、穩(wěn)定性好，特異性、敏感性強?？捎糜谪iJEV抗體的檢測。

乙型腦炎病毒;ELISA

乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)又稱日本腦炎，是由黃病毒科(Flaviridea)黃病毒(flavivirus)乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人畜共患自然疫源性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病。豬是本病的主要傳染源，能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎。該病在大多數(shù)養(yǎng)豬場呈地方性流行，陽性率達20%～30%。人感染后死亡率達30%以上，另外有50%會留下神經(jīng)系統(tǒng)方面的后遺癥，目前還沒有人感染JEV后完全治愈的報道［1－2］。

近年來隨著生物醫(yī)學的不斷發(fā)展，小型豬作為實驗動物應用越來越廣泛。而乙型腦炎病毒對小型豬也同樣會構(gòu)成嚴重的威脅，對飼養(yǎng)人員和實驗人員也存在著潛在的危險性。為保證小型豬作為實驗動物的質(zhì)量和使用的安全性，有必要對其進行乙腦的檢測。我國現(xiàn)行國家標準中沒有對實驗用小型豬乙型腦炎病毒的檢測做出相應的規(guī)定。本實驗旨在建立靈敏度高、特異性強、操作簡便的ELISA方法，對JEV抗體進行檢測，為推動了實驗用小型豬標準化進程及中國實驗用小型豬的質(zhì)量控制奠定基礎［3］。

1 材料和方法

1.1 主要材料

JEV毒種(Nakayama-NIH)、無 JEV抗體牛血清:由本所疫苗一室提供;BHK21細胞:本室凍存;山羊抗豬IgG-HRP:KPL公司產(chǎn)品;豬標準陰、陽對照血清:中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)診斷室提供;JEV ELISA檢測試劑盒:北京索奧生物技術(shù)有限公司和深圳市綠詩緣生物技術(shù)有限公司;血清來源:某小型豬飼養(yǎng)場。

1.2 主要儀器

酶標儀:Thermo Multiskan MK3;熒光顯微鏡:Olypus IX;37℃水浴箱:上海森信實驗儀器有限公司DK-4500B型;37℃培養(yǎng)箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 病毒感染力滴度(TCID50)測定:將病毒液以10－1～10－11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有BHK21細胞的96孔細胞培養(yǎng)板(costor)(1～11列)，每個稀釋度接種1列(8孔)，第12列不加病毒，作為細胞對照。置37℃培養(yǎng)觀察10 d，記錄結(jié)果。

1.3.2 抗原的制備及純化:正?？乖?BHK21細胞長成單層，常規(guī)法消化，PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，沉淀溶于適量PBS凍融3次后，超聲破碎，10 000 r/min離心 30 min，取上清液，并測蛋白含量。

特異抗原:收獲 JEV細胞毒于4℃，10 000 r/min離心1 h，取上清于4℃，40 000 r/min離心3 h，收集沉淀于適量PBS中。再經(jīng)20%蔗糖離心后，用紫外分光光度法測定抗原蛋白含量。

1.3.3 判斷標準的確定:依據(jù)國標選擇A490來讀取吸光度。在陰、陽對照成立的情況下，待檢血清特異抗原孔A值≥0.2、待檢血清特異抗原孔A值/陰性對照特異抗原孔A值≥2.1，判為陽性［5］。

1.3.4 正?？乖c特異抗原、酶結(jié)合物最佳工作濃度的確定:將陰、陽對照血清和備檢血清1∶40稀釋［4］。正?？乖謩e以 0.05、0.1、0.2、0.4 μg/mL進行包被，特異抗原分別以5、10、20 μg/mL進行包被，羊抗豬 IgG-HRP以 1∶5 000～1∶64 000倍比稀釋，通過方陣來確定正常、特異抗原和酶結(jié)合物最佳工作濃度［5］。

1.3.5 特異性試驗:(1)玻片免疫熒光試驗:接種JEV的單層BHK21細胞，病變達80%～90%時滴片，同時設正常細胞對照。標準 JEV陰、陽血清1∶10稀釋［6］，進行玻片免疫熒光試驗。(2)用已建立的ELISA法分別檢測豬瘟(CSFV)和豬細小病毒(PPV)、標準陰、陽血清。同時設 JEV標準陰、陽血清對照。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗:將4℃放置0、30和90 d的3個不同批次抗原包被板，同時檢測已知4份陰性和4份陽性血清，計算 A490變化率(相對偏差)，確定ELISA 法的時間穩(wěn)定性［8］。

1.3.7 精密性試驗:同一份陽性血清的同一稀釋度用同一批板同時做 20孔，計算 A490的變異系數(shù)［7］。

將4℃放置0、30、60和90 d的4個不同批次抗原包被板，同時檢測不同抗體水平的同8份陽性血清和同8份陰性血清，進行批間重復性試驗，計算批間變異系數(shù)［7］。

1.3.8 靈敏性試驗:JEV抗體陽性血清從1:40開始作系列倍比稀釋，用建立的ELISA法進行檢測，最大稀釋比例陽性孔(A490≥0.2)為其檢測靈敏度［7］。

1.3.9 可信度:用建立的ELISA方法，對應用商品化ELISA抗體檢測試劑盒檢測過的已知陰、陽血清60份進行檢測，驗證此方法的可信度［7］。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染力滴度

TCID50為 10－10.25/mL。

2.2 BHK21正常抗原蛋白含量為:1.6789 mg/mL;特異抗原JEV蛋白含量為5.3125 mg/mL。

2.3 正常、特異抗原和羊抗豬 IgG-HRP最佳工作濃度分別為 0.2、10 μg/mL 和 1∶20 000。

2.4 特異性實驗

(1)免疫熒光試驗

JEV陰性血清與病毒感染細胞和正常細胞均無綠色熒光反應;JEV陽性血清與正常細胞無熒光反應，與病毒感染細胞呈強綠色熒光反應(圖1和圖2，見彩插 3)。

(2)在JEV陰、陽對照均成立的條件下，與豬瘟(CSFV)和豬細小(PPV)病毒陰、陽血清均無特異性反應。

2.5 穩(wěn)定性

8份血清的 A值變化率(相對偏差)均小于25%。

2.6 精密性

正常、特異抗原批內(nèi)的變異系數(shù)(CV)分別為8.3%和6.4%;正常、特異抗原批間平均變異系數(shù)(CV)分別為9.7%和11.5%。

2.7 靈敏度

間接ELISA實驗靈敏度測定結(jié)果見表1。

表1 間接ELISA實驗靈敏度測定結(jié)果(A490)Tab.1 The sensitivity of the ELISA detection method

2.8 應用

ELISA方法檢測已知陰、陽血清結(jié)果見表2。

表2 ELISA方法檢測已知陰、陽血清結(jié)果Tab.2 Detection results of negative and positive sera with the ELISA technique

46份陰性血清檢測出3份陽性，43份陰性，陰性血清檢測符合率為93.5%;6份陽性血清檢測結(jié)果均為陽性，陽性符合率為100%;8份可疑血清中，檢測出7份陽性，1份陰性。

3 討論

本試驗用BHK21細胞培養(yǎng)JEV全病毒作抗原，雖經(jīng)過蔗糖純化，但也會存在細胞類等非特異性物質(zhì)，為排除細胞類等物質(zhì)可能引起的非特異性反應，同時用處理過的BHK21細胞作正常抗原做對照，可以有效排除非特異性反應而造成的假陽性，提高了檢測結(jié)果的特異性和準確性。

ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)都小于10%，批間平均變異系數(shù)都小于15%，說明精密性良好;靈敏度達到1∶1280，說明敏感性很強;免疫熒光試驗證明ELISA所用JEV抗原的特異性很強;而且與豬瘟和豬細小病毒均無交叉反應［8］。

本試驗開始用建立的檢測方法檢測已知60份血清，結(jié)果顯示，抗體陽性率幾乎為100%，后用經(jīng)檢測無JEV抗體牛血清配制的稀釋液，作為待檢血清和酶的稀釋液，檢測結(jié)果為陽性血清16份，陰性血清44份，陽性率為26.7%，與文獻報道豬JEV感染率為 20%～30% 相符［1］。

可信度試驗中，已知6份陽性血清檢測結(jié)果均為陽性;8份可疑血清中，有7份陽性，1份陰性;46份陰性血清中，有3份陽性，43份陰性。說明本試驗建立的ELISA方法檢測敏感性更高。

建議在制定實驗用小型豬飼養(yǎng)管理標準方面，希望能對小型豬進行JEV疫苗免疫接種，以保證飼養(yǎng)人員及實驗人員的健康與生命安全。而且希望能在今后的工作中，對疫苗接種免疫后小型豬的抗體變化規(guī)律進行摸索和研究，為小型豬JEV檢測標準的制定提供可靠的數(shù)據(jù)。

本實驗建立的 ELISA方法，具有操作簡便、快速、敏感性好、特異性強、檢測準確性高等特點［8］，為今后小型豬JEV檢測工作和ELISA抗體檢測試劑盒的研制及實驗用小型豬的質(zhì)量控制及標準化奠定了基礎。

［1］張永欣，符芳，宋淑萍，等.中國東北地區(qū)3株日本腦炎病毒株的分離鑒定及基因分型［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40(6):73－78.

［2］Khatun S，Nara S，Tripathi V，et al.Development of ELISA for measurement of progesterone employing 17-alpha-OH-P-HRP as enzyme label［J］.J Immunoassay Immunochem，2009，30(2):186－196.

［3］范薇，隋麗華，高正琴，等.兩個小型豬種群的部分細菌攜帶情況調(diào)查［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19(2):4－8.

［4］中華人民共和國國家標準 實驗動物 微生物學檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗［S］.GB/T 14926.50-2001，1－4.

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［6］中華人民共和國國家標準 實驗動物 微生物學檢測方法.免疫熒光試驗［S］.GB/T 14926.52－200110－12.

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Establishment of an ELISA Technique in Detecting Japanese Encephalitis Virus Antibody

WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，GAO Zheng-qin，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biology Products，National Center for Microbiological and Genetic Monitoring of Laboratory Animals，Beijing 100050，China)

Objective To establish an ELISA detection method for Japanese encephalitis virus(JEV)antibody.Methods BHK21cells were cultured and JEV virus was vaccinated.The normal BHK21antigen and JEV-specific antigen were prepared.The optimal working concentration of enzyme conjugate and the normal or specific antigens were titrated，and the accuracy，sensitivity，stability and specificity were tested.Result The best working concentrations of normal and specific antigens and the enzyme conjugate were 0.2 μg/mL，10 μg/mL and 1 ∶20000，respectively.The intra-assay coefficient of variation of normal antigen and special antigen was 8.3%and 6.4%，and the inter-assay average coefficient of variation was 9.7%and 11.5%，respectively.The detection sensitivity was 1∶1280.There was no cross-reactivity with classical swine fever virus(CSFV)and porcine parvovirus(PPV).The stability test showed a relative deviation less than 25%.Conclusion The established ELISA method has good reproductivity，stability，specificity and sensitivity，and can be used in detection of pig JEV antibody.

JEV;ELISA;Detection，method

R-33

A

1671-7856(2010)08-0056-04

2010-03-16

圖1 JEV陽性血清與正常BHK21細胞反應
Fig.1 Normal BHK21 cells

圖2 JEV陽性血清與JEV感染BHK21細胞反應
Fig.2 JEV-infected BHK21 cells

“國家科技支撐計劃”:動物源性生物材料病毒安全性檢測技術(shù)研究(2008BAI54B06)。

王吉(1974-)，女，助理研究員，研究方向:微生物學和免疫學。

賀爭鳴(1957－)，男，研究員，博士，研究方向:微生物學和免疫學。E-mail:zhengminghe57@163.com