李樹梅，張發(fā)明，李應超，歐長波，葉福芳，陳 慧，何 誠

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193;2.北京市獸醫(yī)生物藥品廠，北京 102209;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107)

烏梅酸棗仁提取物對人工感染雞大腸桿菌病的防治效果

李樹梅1，張發(fā)明2，李應超3，歐長波1，葉福芳1，陳 慧1，何 誠1

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193;2.北京市獸醫(yī)生物藥品廠，北京 102209;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107)

目的 實驗室評價烏梅酸棗仁提取物對雞致病性大腸桿菌病的療效。方法 根據前期研究自擬烏梅酸棗仁提取物配方，以體外試管二倍稀釋法測定其最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，建立雞致病性大腸桿菌病模型，評價其預防和治療雞大腸桿菌病療效。結果 體外試驗顯示其最小抑菌濃度為12.5 mg/mL;人工感染雞大腸桿菌病模型顯示預防試驗中烏梅酸棗仁提取物高、中、低劑量組、利好對照組、感染對照組的成活率分別為50%、70%、50%、60%、10%;肝臟細菌檢出率均為 100%。治療試驗中上述各組成活率分別為62.5%、50%、37.5%、62.5%、25%;肝臟細菌檢出率均為100%。結論 體外、體內試驗結果表明，烏梅酸棗仁提取物能有效減少人工感染后的臨床癥狀，保護率為50%～70%，推薦使用劑量為200 mg/kg體重，可以替代部分抗生素防治此病。

烏梅酸棗仁提取物;雞大腸桿菌病;體外試驗;體內試驗

烏梅(Fructus mume)是由薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.干燥近成熟的果實加工而成［1］。研究表明，濃度為1.44 mg/mL的烏梅水煎劑可以使28株大腸桿菌100%受到抑制［2］。同時發(fā)現(xiàn)其醇浸漬液對沙門氏菌、銅綠假單胞菌作用敏感［3］。酸棗仁為鼠李科植物酸棗 Ziziphus jujuba Mill.var.spiona(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種仁［1］，現(xiàn)代藥理實驗證實酸棗仁皂苷具有明顯的免疫調節(jié)和抗組胺釋放的活性，主要應用于鎮(zhèn)靜和催眠作用以及抗驚厥作用，也用于血管保護及免疫增強［4，5］。前期研究顯示烏梅提取物具有抗禽流感(H9亞型)病毒活性、抗新城疫病毒活性以及抗雞傳染性法氏囊病病毒活性［6］。從烏梅中提取得到的化合物V對于肉雞大腸桿菌病具有較好的預防保護效果［7］，酸棗仁乙醇提取物對于肉雞實驗感染大腸桿菌病具有較好的防治效果，保護率優(yōu)于硫酸新霉素［8］。烏梅提取物Q和酸棗仁提取物S1能明顯降低雞毒霉形體的發(fā)病率、減少氣囊的損傷［9］。烏梅酸棗仁提取物由烏梅、酸棗仁提取物組成，經過不同比例篩選而成，具有成本低、療效高、安全性高的特點。

大腸桿菌病是由致病性血清型大腸桿菌引起的一種雞的常見傳染病，不同品種不同日齡的雞均可感染，臨床防治措施主要依賴使用大量的抗生素。大量抗生素濫用導致藥物敏感性下降、耐藥性增加以及藥物殘留，嚴重影響著我國養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益，威脅動物性食品安全。因此，烏梅酸棗仁提取物對耐藥性大腸桿菌有效，無殘留、安全綠色環(huán)保等優(yōu)勢。本實驗旨在探討人工感染致病性大腸桿菌后，烏梅酸棗仁提取物是否具有預防和治療價值。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂、牛肉浸膏、麥康凱干粉培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術有限責任公司。麥康凱平板按常規(guī)法制備，滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

158只18日齡的健康海蘭褐雞，由河北省高碑店市富強種雞孵化場提供。飼養(yǎng)管理按照種雞飼養(yǎng)管理手冊進行常規(guī)飼喂。

1.3 藥物

利好(20%復方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉):由某動物保健有限公司贈送，批號2008102409。以滅菌生理鹽水配制成最終濃度為15 mg/mL的口服溶液。

烏梅、酸棗仁:購自河北省安國中藥材批發(fā)市場。烏梅酸棗仁提取物濃度為200 mg/mL，其中每毫升藥液中含有烏梅酸棗仁提取物200 mg，由實驗室制備。

1.4 菌種

致病性雞大腸桿菌從臨床患病雞肝臟分離獲得，經生化試驗和動物試驗鑒定為臨床致病性大腸桿菌，血清型為O15(大腸桿菌單因子血清來自中國獸藥監(jiān)察所)，由中國農業(yè)大學實驗動物研究所保存。

1.5 體外試驗

最小抑菌濃度(MIC)測定:采用試管二倍稀釋法［10］測定烏梅酸棗仁提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。取11支滅菌具塞試管，每只試管中各加入滅菌肉湯2mL。第1管加入滅菌藥液2mL，混勻后取2mL放至第2管中，依次倍比稀釋至第9管，第10管作為陽性對照不加藥液，第11管作為感染對照加入提取物2mL混勻后棄去2mL。于1～10管中加入2mL大腸桿菌菌液，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日觀察結果。眼觀選出無細菌生長的各管，分別取其液體涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。為消除藥物本身的影響，將不能完全確定的試管液體轉接于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，次日觀察平皿中有無細菌生長。為消除試驗偶然性，確定其重復性及可靠性，將本試驗重復三次。

1.6 體內試驗

1.6.1 雞致病性大腸桿菌LD50的測定:將50只18日齡的雞隨機分成5組，分別為4×109CFU組，4×108CFU組，4×107CFU組，4×106CFU組，空白對照組，每組10只。每只腹腔注射菌液0.5mL。觀察每組雞的死亡率，確定大腸桿菌的LD50。

1.6.2 試驗分組:預防、治療試驗分組情況一致，均將18日齡的雞隨機分為6組，分別是烏梅酸棗仁提取物高、中、低劑量組、利好對照組、感染對照組(感染對照組)，空白對照組，預防試驗每組10只，治療試驗每組8只。

1.6.3 攻毒和給藥方式［7］:腹腔注射菌液，0.5mL/只。預防試驗按照口服灌胃給藥3 d后攻毒，之后再給藥3 d。治療試驗按照攻毒后給藥，連續(xù)給藥5 d，分上、下午兩次。其中預防用藥減半，停藥觀察3 d后剖檢。分組及給藥情況詳見表1。

表1 試驗分組及給藥Tab.1 The test groups and dosages with the herb medicines

1.6.4 療效評價:大腸桿菌感染標準:腹腔氣囊出現(xiàn)纖維素滲出，肝臟被膜出現(xiàn)滲出，心包炎，判斷為大腸桿菌感染死亡。發(fā)病率:接種細菌后表現(xiàn)為精神不振、扎堆、縮頸、排黃白稀糞等癥狀的雞數與該組總數比值。死亡率:試驗期間，剖檢觀察出現(xiàn)大腸桿菌病典型癥狀并導致死亡，死亡率即發(fā)生死亡的雞數與該組總數的比值。相對增重率:根據試驗開始及結束時每只雞的體重，計算增重及每組雞的平均增重，并以空白對照組增重為100%，各組增重與之相比得到各組相對增重率。大腸桿菌檢出率:試驗結束后剖檢存活雞，取肝臟分離培養(yǎng)和鑒定大腸桿菌，統(tǒng)計肝臟大腸桿菌陽性檢出率。

1.6.5 數據的分析與處理:采用SPSS(13.0)統(tǒng)計處理軟件進行數據的顯著性檢驗，試驗數據用(±s)表示。其中死亡率、成活率均用卡方檢驗，相對增重率采用 t檢驗。

2 結果

2.1 最小抑菌濃度的確定

試驗發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物具有一定的體外抑菌作用，最小抑菌濃度為12.5 mg/mL(表2)。

表2 最小抑菌濃度(MIC)測定結果Tab.2 Determination of minimal inhibitory concentration in the chickens with the pathogenically E.coli strain

2.2 半數致死量的確定

各試驗組動物在腹腔注射菌液后，于12 h內開始出現(xiàn)精神遲鈍，垂翅，呆立，食欲減少等癥狀。死亡多發(fā)生于接種后24～48 h，對照組無死亡。以Karber法計算半數致死量，即lg LD50=L+d×(S－0.5)，其中L為最低稀釋度的對數;d為組距(稀釋倍數的對數);S為死亡比值之和，由此可以確定半數致死量為4×108CFU(表3)。

表3 雞人工感染致病性大腸桿菌LD50測定Tab.3 Determination of LD50in chickens with the pathogenically E.coli strain

2.3 預防試驗結果

2.3.1 口服藥物后對雞增重的影響:高、中、低劑量組的相對增重率分別為36.25%、34.76%和11.3%，呈劑量效應關系，利好對照組為27.43%。統(tǒng)計學分析表明:高、中、低三個劑量組以及利好對照組的相對增重率均顯著高于感染對照組(P＜0.05)(表4)。

2.3.2 口服藥物后對發(fā)病率、成活率的影響:人工感染大腸桿菌7 d后，感染對照組成活率10%，烏梅酸棗仁提取物中劑量組成活率為70%，差異顯著(P＜0.05)(表5)。

2.4 治療試驗結果

2.4.1 口服藥物后對雞增重的影響:高、中、低劑量組的相對增重率分別為33.81%、40.21%和103.09%，利好對照組為 98.97%，與感染對照組(71.34%)相比較，差異不顯著(表6)。

表4 預防實驗中口服藥物對雞增重的影響Tab.4 Effects of the herb medicine on body weight in the prophylaxis experiment

表5 口服藥物后對發(fā)病率、成活率的影響Tab.5 The effect of herb medicines on the chicken morbidity，mortality and bacterial clearance in curtio experiment

表6 口服藥物后對雞增重的影響Tab.6 The effects of herb medicine on body weight gain

2.4.2 口服藥物后對發(fā)病率、成活率的影響:人工感染大腸桿菌7 d后，烏梅酸棗仁提取物三個劑量組成活率分別為62.5%，50%，37.5%，利好對照組為62.5%，均明顯高于感染對照組(25%)，但差異不顯著。肝臟細菌分離率均為100%(表7)。

表7 口服藥物后對發(fā)病率、成活率的影響Tab.7 The effects of the herb medicines on morbidity，mortality and bacterial clearance in curatio experiment

3 討論

3.1 烏梅酸棗仁提取物體外、體內對雞大腸桿菌療效評價

體外試驗結果顯示烏梅酸棗仁提取物具有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度達到12.5 mg/mL。體內采用人工感染大腸桿菌，預防試驗結果顯示其相對增重率呈效應－劑量關系，高、中、低三個劑量組的相對增重率分別為36.25%、34.76%和11.3%，增重效果均明顯高于感染對照組(負增重30.56%)，且差異顯著(P＜0.05)。其中高、中劑量組(36.25%、34.76%)的增重效果優(yōu)于陽性(利好)對照組(27.43%)。在成活率方面，三個劑量組的成活率也明顯高于感染對照組(10%)，中劑量組的成活率(70%)與感染對照組相比較差異顯著(P＜0.05)。在治療實驗中發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物高、中、低三個劑量組的成活率呈效應－劑量關系，成活率分別為62.5%、50%和37.5%，明顯高于感染對照組(25%)，其中高劑量組的成活率與陽性(利好)對照組(62.5%)相當。

根據《中國獸藥典》2005版烏梅項下規(guī)定可知，烏梅中檸檬酸含量不得少于15.0%，同時含有大量的蘋果酸，這說明烏梅中含有大量的有機酸。在動物機體能量代謝中，檸檬酸是動物體內糖、脂肪和蛋白質代謝的中間產物，是糖有氧氧化過程中三羧酸循環(huán)的起始物［11］。另外一個防治雞毒支原體實驗中，口服烏梅、酸棗仁提取物可以顯著增加血液中白細胞總數和單核細胞數量，從而增強感染雞的細胞免疫功能。這提示烏梅酸棗仁提取物可能通過提高家禽機體非特異性免疫力達到保護家禽免受大腸桿菌的侵害，而非通過殺滅或抑制機大腸桿菌途徑。因此，實驗顯示不能完全清除肝臟中大腸桿菌。另一方面，口服烏梅酸棗仁提取物后能顯著增加體重，這說明該藥物通過增加感染雞的采食量，增強非特異性免疫功能達到抵抗細菌感染的目的。

3.2 烏梅酸棗仁提取物防治雞大腸桿菌潛在的市場價值

當前畜禽養(yǎng)殖業(yè)控制大腸桿菌病主要依賴抗菌素，同時大量抗菌素的濫用導致大腸桿菌出現(xiàn)耐藥性，加劇了細菌性傳染病防治難度。另一方面藥物殘留也嚴重影響我國肉雞出口產業(yè)，嚴重危害著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)經濟效益，威脅人類食品安全和身體健康等。

烏梅酸棗仁提取物具有毒副作用小、資源豐富、價格低廉等特點，其中烏梅主產地在四川、福建和浙江3省，酸棗仁則主要分布在西北、東北、華北許多省區(qū)及南方的一些地區(qū)。在實驗室驗證實驗中和臨床實驗中發(fā)現(xiàn)其適口性比較好，可以顯著增加肉雞的采食量，這有別于其它中藥適口性。本實驗中發(fā)現(xiàn)烏梅酸棗仁提取物預防效果與知名合資獸藥－利好相當，這也說明利用烏梅酸棗仁提取物有可能部分替代目前的抗生素，解決當前耐藥性性大腸桿菌問題，保障動物性食品安全。

以上實驗結果顯示烏梅酸棗仁提取物按200 mg/kg體重口服，連續(xù)使用5 d，可以有效防治致病性大腸桿菌人工感染，增加采食量，提高增重。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典［S］.北京:中國農業(yè)出版社，2006.

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［3］陳星燦，劉定安.中藥抗菌作用研究［J］.中醫(yī)藥學報，1998，26(1):36－37.

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［5］陳百泉，杜鋼軍，許啟泰.酸棗仁皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用［J］.中藥材，2002，25(6):429－430.

［6］張發(fā)明.烏梅生物活性部位初步篩選及有效成分結構解析［D］.北京:中國農業(yè)大學碩士論文，2009.

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［8］李應超.酸棗仁混懸液的提取工藝、質量控制、毒理學及藥效學研究［D］.北京:中國農業(yè)大學碩士論文，2009.

［9］王玉珍.烏梅和酸棗仁提取物抗雞毒霉形體感染的研究［D］.武漢:華中農業(yè)大學碩士論文，2009.

［10］李儀奎.中藥藥理試驗方法學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1991:36－38.

［11］鄒思湘.動物生物化學(第4版)［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2005:150－151.

Prevention and Cure Effects of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae Extract against Chicken Colibacillosis

LI Shu－mei1，ZHANG Fa－ming1，LI Ying－chao1，OU Chang－bo1，YE Fu－fang1，CHEN Hui1，HE Cheng1
(1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China;2.Beijing Veterinary Biological Products Factory，Beijing 102209，China;3.Beijing Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100107，China)

Objective To assess the pharmacological effects of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract against avian colibacillosis.Methods Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract was manufactured according to the previous study.Minimal Inhibitory Concentration(MIC)was determined by two－fold dilution method in vitro.Chickens administered orally with the solution were challenged with virulent E.coli strain in vivo.Results The MIC of Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract was determined to be 12.5 mg/mL.In prophylaxis test，the bird survival rate was 50%，70%，50%，60%and 10%，respectively in higher dose，medium and low dose group，positive group and negative group while all infected livers were positive for the isolated E.coli.In other cure experiment，the survival rate was 62.5% ，50%，37.5%，62.5%and 25%%，respectively in above mentioned groups.Meanwhile，positive E.coli was determined to be 100%in the infected chicken livers.Conclusions The infected chickens were able to get 50%～70%protection with 200 mg/kg。The herb oral solution is promising to replace the commercial antibiotics in control avian colibacillosis.

Fructus mume and Semen ziziphi spinosae extract;Avian colibacillosis;In vivo;In vitro

S858.31

A

1671－7856(2010)06－0049－05

2010－01－11

李樹梅(1984－)，女，碩士生，研究方向:實驗動物學。

何誠(1966－)，男，博士，教授，博士生導師。E－mail:hehonest@yahoo.com.cn