周亞光,蘇明華,楊光田

缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷與細(xì)胞內(nèi)過高的鈣離子水平密切相關(guān)。臨床上常通過抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣超載、維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)來控制和治療腦缺血性損傷。左旋四氫巴馬汀(L-tetrahydmpalmatine,l-THP)為中藥延胡索的主要成分延胡索乙素的左旋物。近年研究表明左旋四氫巴馬汀具有抗腦缺血再灌注損傷[1,2]、抗心律失常[3]、鈣拮抗[4]等作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立藥物誘導(dǎo)細(xì)胞鈣超載損傷模型,應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù),觀察l-THP對海馬神經(jīng)細(xì)胞中胞漿游離鈣的影響,并探討其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 乳鼠(出生1 d～2 d),雌雄兼用。由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。分為4組:空白對照組,l-THP 1μmol/L組,1-THP 10μmol/L組,1-THP 100 μmol/L組。

1.2 藥品和試劑 l-THP購自廣東省博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司,溶于蒸餾水中配成l mmol/L母液,每次實(shí)驗(yàn)時,把母液溶于D-HANKS液中,配成實(shí)驗(yàn)所需濃度。Fluo-3/AM購自Sigma公司,用二甲基亞砜配成保存液,儲存于-20℃冰箱中。B27、多聚賴氨酸、Caffeine均購于 Sigma公司,胎牛血清、馬血清、DMEM/F12培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)InsightPlus(美國Meridian公司);Olympus IX-70倒置顯微鏡(Japan)。

1.4 新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)[5]新生乳鼠冷凍麻醉后,無菌條件下分離海馬并置入冰冷D-HANKS液中。將細(xì)胞懸液滴在預(yù)先用50μg/mL多聚賴氨酸(Sigma,USA)包被的玻片上,并放入 35 mm培養(yǎng)皿中。于37℃ 、飽和濕度、5%CO2、95%空氣條件下培養(yǎng),24 h后換維持培養(yǎng)基(DM EM/F12+B27培養(yǎng)基),然后每周換液 2次。于培養(yǎng)第5天加入 3μg/mL阿糖胞苷作用48 h,以抑制膠質(zhì)細(xì)胞等非神經(jīng)元的生長。

1.5 海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+]i)變化測定[6]于培養(yǎng)第7天時,將分離的細(xì)胞從維持培養(yǎng)基中換到標(biāo)準(zhǔn)人工腦脊液(ACSF液)中。隨后將海馬神經(jīng)元細(xì)胞置于Fluo-3/AM(20 Umol/L的負(fù)載液中,于37℃孵育30 min。去除負(fù)載液,并洗滌3次。在光鏡下找到形態(tài)完整,突觸清晰的細(xì)胞,對其進(jìn)行激光掃描測定。Fluo-3/AM被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后,被酯酶水解釋出Fluo-3,Fluo-3與Ca2+結(jié)合,受488 nm的激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光,其熒光值與[Ca2+]i呈正相關(guān),即以熒光值變化表示[Ca2+]i變化。在激光掃描共聚焦顯微鏡time series程序下對細(xì)胞XY平面進(jìn)行掃描,間隔時間為2 s,共掃描120次。計算細(xì)胞XY平面內(nèi)平均熒光強(qiáng)度,以平均熒光強(qiáng)度代表[Ca2+]i,以熒光值增高或下降百分比來衡量細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量變化。

2 結(jié) 果

2.1 1-THP對靜息狀態(tài)下[Ca2+]i的影響 將 Fluo-3/AM 標(biāo)記的細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)人工ACSF中,于掃描第2次和第3次之間加入不同濃度的1-THP,對照組加入相同體積的生理鹽水。結(jié)果顯示應(yīng)用1-THP,各加藥組的鈣熒光強(qiáng)度值與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 靜息狀態(tài)下各組神經(jīng)元細(xì)胞的鈣熒光強(qiáng)度值(±s)

表1 靜息狀態(tài)下各組神經(jīng)元細(xì)胞的鈣熒光強(qiáng)度值(±s)

組別 0 s 50 s 100 s 150 s 200 s 240 s Control 973.6±7.8 976.2±10.6 968.9±17.3 976.9±14.0 970.0±9.5 971.9±11.2 l-THP 1μmol/L 973.4±10.2 964.3±14.8 972.4±10.3 967.8±8.6 965.1±9.8 968.8±7.8 l-THP 10μmol/L 975.1±7.8 968.3±7.8 970.5±5.1 970.4±9.7 967.1±10.7 972.0±16.3 l-THP 100μmol/L 972.9±5.7 973.3±3.8 974.8±8.1 973.8±5.5 973.3±6.7 976.2±5.5注:與對照組比較 P＞0.05。

2.2 1-THP對KCl去極化致[Ca2+]i升高的影響 在盛有標(biāo)準(zhǔn)ACSF液的浴槽中加入標(biāo)記細(xì)胞和相應(yīng)濃度1-THP,對照組加入相同體積的生理鹽水。溫浴5 min后,開始掃描,并在第2次和第3次掃描之間加入終濃度為60 mmol/L的KCl,結(jié)果:對 照組 、lμmol/Ll-THP 、10μmol/Ll-THP 、100μmol/L l-THP峰值熒光強(qiáng)度增加,分別為(64.3±2.8)%、(46.3±3.1)%、(34.2±1.5)%、(20.8±1.2)%(n=6,P＜0.01)。l-THP對KCl引起的胞漿[Ca2+]i升高有抑制作用。

2.3 1-THP對咖啡因致神經(jīng)元細(xì)胞胞漿鈣濃度升高的影響無鈣ACSF液(其配方中CaCl2,用EGTA代替)中加入標(biāo)記細(xì)胞和相應(yīng)濃度1-THP掃描,對照組加入相同體積的生理鹽水。溫浴5 min后,開始掃描,于掃描第2次與第3次之間加入10 mmol/L Caffeine。 結(jié) 果 對 照 組、lμmol/Ll-THP、10 μmol/L l-THP、1 00μmol/Ll-THP峰值熒光強(qiáng)度增加 ,分別為(53.9±4.3)%、(48.2±3.9)%、(44.3±4.6)%、(35.5±3.2)%(n=6,P＜0.05)。l-THP對 Caffeine引起的胞漿[Ca2+]i升高有抑制作用。

3 討 論

神經(jīng)元胞內(nèi) Ca2+超載是缺血性腦損傷的關(guān)鍵因素[7,8]。缺血引起胞漿[Ca2+]i的增加來自于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,細(xì)胞內(nèi)儲存Ca2+釋放以及胞漿Ca2+的外排能力下降。當(dāng)Ca2+內(nèi)流過多或胞內(nèi)儲存Ca2+釋放過多,超出神經(jīng)元對Ca2+的調(diào)節(jié)能力時,引起鈣超載。鈣超載可以通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基、引起線粒體損傷以及激活蛋白激酶等三種途徑引起神經(jīng)元死亡[9]。因此,預(yù)防損傷引起的細(xì)胞內(nèi)鈣超載,能有效地防治缺血性腦損傷。

本實(shí)驗(yàn)采用的2種神經(jīng)元損傷模型均屬藥物誘導(dǎo)的鈣超載損傷模型。①過量KCl可使細(xì)胞去極化,開放電壓依賴性鈣通道引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載。②高濃度咖啡因可在細(xì)胞外無鈣的環(huán)境下,刺激神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的蘭尼啶受體(Ry R)調(diào)控的鈣池,引起胞內(nèi)鈣的釋放,造成細(xì)胞損傷。對于兩種鈣超載模型。本研究運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)動態(tài)、定量地研究了左旋四氫巴馬汀對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鈣超載的影響。結(jié)果顯示(1～100)μmol/L1-THP對靜息狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)鈣無影響,說明它不參與自發(fā)的外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放,不影響靜息狀態(tài)下的細(xì)胞功能。低濃度的1-THPμmol/L可輕微抑制由KCl誘導(dǎo)的內(nèi)鈣增多;當(dāng)增加1-THP達(dá)100μmol/L時,可顯著抑制由KCl誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加,這種抑制作用與左旋四氫巴馬汀劑量有關(guān)。另外,當(dāng)用Caffeine刺激細(xì)胞內(nèi)鈣庫時,左旋四氫巴馬汀可抑制細(xì)胞的內(nèi)鈣增多。因此,推測左旋四氫巴馬汀對兩種類型的神經(jīng)元損傷模型所導(dǎo)致的鈣超載,均有保護(hù)作用。即不僅抑制電壓依賴性鈣通道開放所致的鈣內(nèi)流,而且對鈣庫釋放鈣也有影響。由于左旋四氫巴馬汀對KCl誘導(dǎo)的鈣超載的抑制程度強(qiáng)于Caffeine刺激細(xì)胞內(nèi)鈣庫誘導(dǎo)的鈣超載,表明電壓門控型鈣通道對左旋四氫巴馬汀的作用更敏感。

盡管本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)左旋四氫巴馬汀能夠通過作用于電壓門控型鈣通道和細(xì)胞內(nèi)蘭尼啶受體(Ry R)調(diào)控的鈣池,來減輕損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載。但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元膜上已成功地記錄出了 L、N、P、Q、R、T等 6種類型的電壓依賴型鈣通道,它們有各自不同的電生理學(xué)特征。左旋四氫巴馬汀具體作用于那種類型的電壓依賴型鈣通道以及如何干預(yù)這些電壓依賴型鈣通道還不清楚,仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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