王 陶，李 文，陳宏偉，陳小龍，刁進進

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

蟲草素的微波-超聲波協(xié)同提取

王 陶，李 文，陳宏偉，陳小龍，刁進進

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

研究蛹蟲草菌絲體中蟲草素的提取工藝及檢測方法。確定微波-超聲波協(xié)同提取法為蟲草素提取的最佳方法，依據(jù)單因素和正交試驗獲得最佳的提取工藝：乙醇體積分數(shù)70%、提取功率200W、提取時間110s、料液比1:240(g/mL)。此時蟲草素含量達9.228mg/g。采用紫外分光光度法測定樣品中蟲草素含量，回收率為97.41%～99.60%，RSD為1.469%，準確度和精密度都較高，是一種方便、成本較低的檢測方法。

蛹蟲草；蟲草素；微波-超聲波協(xié)同提??；紫外分光光度法

Abstract：Single factor and orthogonal array design methods were used to investigate an optimal procedure for the extraction of cordycepin from cultured mycelia of Cordyceps militaris with the assistance of microwave combined with ultrasonic. Besides,a UV spectroscopic method was developed for the assay of cordycepin and its figures of merit were evaluated. Results showed that the optimal values of crucial technological parameters affecting cordycepin yield were as follows: ethanol concentration 70%, microwave power 200 W, material/liquid ratio 1:240 (g/mL) and extraction time 110 s. Under such conditions, a cordycepin yield of up to 9.228 mg/g was obtained. The developed analytical method exhibited mean recoveries ranging from 97.41% to 99.60% of 3 replicates for cordycepin in a real sample spiked at 3 levels and both high accuracy and precision so as to provide a convenient and cost saving method for the assay of cordycepin.

Key words：Cordyceps militaris；cordycepin；microwave-ultrasonic assisted extraction；UV spectrophotometry

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、蛹草、蛹草菌、北蟲草等，分類學上屬于真菌門(Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotinia)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Claviciptiaceae)、蟲草屬(Cordycps)，是極有開發(fā)價值的藥、食兩用滋補真菌[1-2]。蟲草素即蟲草菌素，早在1950年，由加拿大的Cunningham等[3]從蛹蟲草的培養(yǎng)物中分離并鑒定出的，其結(jié)構(gòu)與腺苷非常相似，所以又稱為3＇-脫氧腺苷。后來Kaczka等[4]從無冠構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中亦分離出這種物質(zhì)，這是迄今在蟲草屬真菌以外唯一報道分離出蟲草素的菌種。蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素[5]，蟲草素具有免疫調(diào)節(jié)的作用[6]、抗腫瘤[7]、抗炎作用[8]、對尖音庫蚊、埃及伊蚊和另一種伊蚊的幼蟲有明顯致死作用以及在治療非洲人類錐蟲病方面將發(fā)揮重要作用[9]等。對于蟲草素的提取一般采取超聲波提取、浸提法、索氏提取、回流法[10-16]、微波提取[17]等方法，目前尚未發(fā)現(xiàn)利用微波超聲波協(xié)同提取蟲草素的相關(guān)報道。而對于蟲草素的檢測，可以采用紫外、高效液相色譜、毛細管電泳等方法[14]，其中，紫外檢測法較為方便、經(jīng)濟，為本研究的后續(xù)工作提供方便。鑒于此，就蟲草素微波超聲波協(xié)同提取工藝進行研究并評價紫外檢測蟲草素的準確度和精密度，以期更好地開發(fā)利用蛹蟲草資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草(Cordyceps militaris)13號菌株，由徐州工程學院食品工程學院實驗室保存。

蟲草素(高純試劑) 中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純) 天津市廣成化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000超聲波微波協(xié)同提取儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HYG搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：SDAY培養(yǎng)基(葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、瓊脂2%)；液體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%。

1.4 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將接種后的斜面于22℃培養(yǎng)7d；液體發(fā)酵培養(yǎng)：22℃、200r/min，培養(yǎng)5～7d。在250mL三角瓶中裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。

1.5 蛹蟲草菌株樣品制備

從搖床培養(yǎng)機上取出培養(yǎng)好的13號蟲草菌株，菌絲體結(jié)球顆粒均勻，4000r/min離心5min，棄上清液，剩下的固型物轉(zhuǎn)移到滅過菌的培養(yǎng)皿里，置于冰箱冷凍。將冷凍好的樣品放在真空冷凍干燥，干燥后研磨成粉，稱其質(zhì)量并做好標記。

1.6 蟲草素的提取

1.6.1 超聲波提取法

精確稱取0.1250g蛹蟲草菌粉5份，分別溶于50mL蒸餾水中，用超聲波清洗機作用。超聲提取時間分別為10、20、30、40、50min，提取后離心過濾，稀釋定容至250mL。

1.6.2 微波提取法

精確稱取0.1250g蛹蟲草菌粉5份，分別溶于50mL蒸餾水中，選用微波-超聲波協(xié)同提取儀中微波作用。先微波60s，功率分別為50、100、200、300、400W作用下，提取后離心過濾，稀釋定容至250mL。

1.6.3 微波-超聲波協(xié)同提取法

精確稱取0.1250g蛹蟲草菌粉5份，分別溶于50mL蒸餾水(若提取溶劑用乙醇，則需用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去乙醇后再定容)，選用超聲波-微波協(xié)同提取儀中微波和超聲波協(xié)同作用。選擇微波時間60s，功率分別為50、100、200、300、400W，超聲波頻率40kHz、功率50W，提取后離心過濾，稀釋定容至250mL。

1.6.4 超聲波-微波協(xié)同提取單因素試驗

精確稱取13號蛹蟲草菌絲體0.1250g，按提取基本條件，分別考察乙醇體積分數(shù)10%、30%、50%、70%、90%；微波功率25、50、75、100、150、200、300、400W；微波時間30、50、70、90、110、130、150s；料液比1:120、1:160、1:200、1:240、1:280(g/mL)對蟲草素含量的影響。

1.6.5 超聲波-微波協(xié)同提取正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗進一步考察乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間和料液比之間的相互影響，并確定微波-超聲波協(xié)同提取蛹蟲草菌絲體中蟲草素的最佳工藝參數(shù)。

1.7 分析檢測方法

1.7.1 紫外分光光度法檢測蟲草素含量

精密稱取10mg蟲草素標準品，用超純水溶解，用超聲波清洗機加速溶解，稀釋定容至100mL，制備成100mg/L標準儲備液。利用100mg/L的蟲草素母液，分別配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L的蟲草素溶液，紫外分光光度計全波段掃描1.0mg/L的蟲草素標準品，在259nm波長處有最大吸收峰。以蟲草素質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y制作蟲草素標準曲線見圖1，則Y=0.0688X＋0.0128，R=0.9977。將提取好的樣品測定其吸光度，根據(jù)標準曲線，計算蟲草素的質(zhì)量濃度。

圖1 蟲草素標準曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

1.7.2 蟲草素含量計算

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素的定性檢測

圖2 蟲草素光譜掃描曲線Fig.2 UV absorption spectra of cordycepin standard and sample

蟲草素標準液和提取樣品分別在紫外分光光度計190～490nm波長范圍內(nèi)掃描，在259nm處有最大吸收峰。由圖2即可判定樣品中含有蟲草素。

2.2 最優(yōu)提取方法的確定

表1 3種實驗提取方法Table 1 Comparison among cordycepin yield from cultured mycelia of Cordyceps militaris extracted with the assistance of both microwave and ultrasonic or each of them

采用表1所示的3種方法提取蟲草素，可以看出，蟲草素含量最高的是微波-超聲波協(xié)同提取法，對微波-超聲波協(xié)同提取和微波提取的結(jié)果進行方差分析，T＝34.26＞t0.01＝4.604，表明在α＝0.01水平，兩種提取方法有極顯著性差異。這可能是由于在微波-超聲波協(xié)同作用下，原料細胞部分被充分破壞，有效成分可很容易擴散到提取液中，加之微波振蕩也可使原料顆粒加速運動，有利于擴散，提高溶液的溫度，從而提高提取效果。

2.3 超聲波-微波協(xié)同提取單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對蟲草素含量的影響

圖3 乙醇體積分數(shù)對蟲草素含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the cordycepin content in the extract solution

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，在乙醇體積分數(shù)為70%時提取的蟲草素含量最大，故選擇70%的乙醇作為提取蟲草素的溶劑。

2.3.2 微波功率對蟲草素含量的影響

圖4 微波功率對蟲草素含量的影響Fig.4 Effect of microwave power on the cordycepin content in the extract solution

采用70%的乙醇作為提取溶劑，微波作用時間為60s，由圖4可以看出，隨著微波功率的增加，物質(zhì)的加熱程度也增加，蟲草素能夠容易地被提取出來，在微波功率達到200W之后，蟲草素含量開始遞減，可能是功率太大，產(chǎn)熱更快，使部分蟲草素含量有所損失。故選用最佳微波功率為200W。

2.3.3 微波超聲波協(xié)同作用時間對蟲草素含量的影響

圖5 超聲時間對蟲草素含量的影響Fig.5 Effect of exaction time on the cordycepin content in the extract solution

采用70%的乙醇作為提取溶劑，微波功率為200W，考察不同的微波超聲波協(xié)同作用時間對蟲草素含量的影響，結(jié)果見圖5。微波作用時間為30s時，蟲草素不能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著時間的增加，蟲草素含量增加，在50s時達到一個小峰值，繼續(xù)增加時間，蟲草素含量略有降低，可能是隨著微波時間的增加，溫度急劇升高，導(dǎo)致提取液部分揮發(fā)而使蟲草素的含量有所損失，但隨著時間的繼續(xù)增加，蟲草素含量又有個高的增幅，這就是超聲波的作用效果。故選用最佳協(xié)同作用時間為110s。

2.3.4 料液比對蟲草素含量的影響

圖6 料液比對蟲草素含量的影響Fig.6 Effect of material-to-liquid ratio on the cordycepin content in the extract solution

在乙醇體積分數(shù)、微波功率和協(xié)同提取時間分別為70%、200W和110s的條件下，采用不同的料液比對蟲草素進行提取，結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，隨著提取溶液的增加，更有利于蟲草素的溶出，可能是因為溶劑和原料間的濃度差越大，提取效率越高，目標物質(zhì)越容易溶出，當料液比增加到1:200后，蟲草素含量減少，表明提取基本完全。為節(jié)省后續(xù)處理時間和試劑，選擇最佳料液比為1:200。

2.4 正交試驗確定微波超聲波提取蟲草素的最佳條件

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選擇不同乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波超聲波協(xié)同作用時間及料液比為影響因素，選用L9(34)正交表進行試驗，因素水平表見表2，正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對蟲草素含量的影響次序為D＞C＞B＞A，即料液比＞微波超聲波協(xié)同作用時間＞微波功率＞乙醇體積分數(shù)，其最優(yōu)方案為D3C2B2A2，即蛹蟲草菌絲體以70%乙醇溶液為提取溶劑、料液比1:240(g/mL)、微波功率200W的條件下提取110s。但是由于最佳組合不在試驗設(shè)計中，需做驗證實驗。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental values of cordycepin yield

按照正交試驗優(yōu)選工藝D3C2B2A2和試驗設(shè)計中的最優(yōu)組合D3C2B1A2，平行3次，進行驗證實驗，D3C2B2A2工藝的蟲草素含量平均達9.228mg/g，而D3C2B1A2工藝僅有8.757mg/g。通過差異顯著分析，T＝4.554＞t0.05=2.776，表明在α＝0.05水平兩種提取工藝有顯著性差異，因此，最優(yōu)提取工藝為D3C2B2A2。

2.5 測定方法的評價

2.5.1 紫外分光光度法測定回收率實驗

將超聲波微波協(xié)同提取最佳工藝提取的樣液，定容至250mL，分別量取提取液1.5、2、2.5mL各3份，分別加入10mg/L標準工作液20、20、20、25、25、25、30、30、30μL。結(jié)果見表4。

表4 回收率實驗Table 4 Mean recoveries of 3 replicates for cordycepin in a real sample spiked at 3 levels

從表4可以看出，本實驗回收率為97.41%～99.60%，說明紫外測定的準確性較好，測定結(jié)果可信。

2.5.2 紫外分光光度法測定精密度實驗

從10mg/L蟲草素標準液中分別精密吸取1mL于10mL容量瓶中，用超純水定容，在同一條件下重復(fù)測定6次，得出RSD為1.469%，表明紫外測定的精密度良好。

3 結(jié) 論

由于在交變電磁場的作用下，極性分子間的相互摩擦和碰撞更劇烈，增加了接觸和反應(yīng)的機會，迅速產(chǎn)生大量的熱使細胞破裂，從而使微波有利于細胞中物質(zhì)的提取。超聲波通過在樣品和溶劑之間產(chǎn)生的空穴作用，提高傳質(zhì)速率。微波和超聲波的協(xié)同作用，充分發(fā)揮了兩種提取方法的優(yōu)點，所以提取效率比傳統(tǒng)的方法高得多。

通過3種提取方法的比較得出：微波-超聲波協(xié)同提取法比其他兩種方法(微波法和超聲波法)對蟲草素的提取效果好，具有提取時間較短、提取效率高等優(yōu)點。通過單因素試驗和正交試驗得出微波-超聲波協(xié)同提取蛹蟲草中蟲草素的最佳條件為超聲波40kHz、乙醇體積分數(shù)70%、微波功率200W、提取時間110s、料液比1:240(g/mL)。利用紫外分光光度法檢測提取液中的蟲草素含量，準確度和精密度都較高，較為方便、快捷。利用該方法可檢測出低能離子束修飾蛹蟲草菌株后蟲草素的含量，選育得到了高產(chǎn)蟲草素的菌株[18]。

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Microwave-Ultrasonic Assisted Extraction of Cordycepin from Cultured Mycelia of Cordyceps militaris

WANG Tao，LI Wen，CHEN Hong-wei，CHEN Xiao-long，DIAO Jin-jin
(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Q939.96

A

1002-6630(2010)10-0086-05

2009-08-17

江蘇省“六大人才高峰”資助項目；徐州工程學院校級重點課題(XKY2007103)

王陶(1976—)，男，講師，博士，研究方向為離子束生物工程學和資源微生物學。E-mail：wangtaohf@126.com