倉義鵬，張宏志，董明盛,*

(1.宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 宿遷 223800；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

蘋果渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的工藝優(yōu)化

倉義鵬1，張宏志2，董明盛2,*

(1.宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 宿遷 223800；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定尿素添加量、培養(yǎng)基加水量、氧化鈣添加量為影響酶產(chǎn)率的重要因素，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對固態(tài)發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)納豆激酶的工藝條件進行優(yōu)化。優(yōu)化得到最佳工藝條件為：尿素添加量2.58%、培養(yǎng)基加水量84.06mL、氧化鈣添加量2.65%。采用最優(yōu)化條件進行實驗，結(jié)果表明：納豆激酶產(chǎn)率可達到2150IU/g，比單因素試驗的最高酶產(chǎn)率(1680IU/g)提高了27.98%。以廉價的工農(nóng)業(yè)廢料作為基本培養(yǎng)基獲得了有較高酶活的產(chǎn)品，經(jīng)濟優(yōu)勢明顯。

蘋果渣；納豆激酶；固態(tài)發(fā)酵；工藝優(yōu)化

Abstract ：On the basis of the results of one-factor-at-a-time experiments, urea concentration, water amount and calcium oxide concentration were determined to be the most important factors affecting on nattokinase production. Subsequently, response surface methodology was used to optimize these factors. The results showed that the optimal values of urea concentration,water amount and calcium oxide concentration were 2.58%, 84.06 mL and 2.65%, respectively. Under these conditions, the maximum nattokinase yield was 2150 IU/g, 27.98% higher than that obtained in one-factor-at-a-time experiments (only 1680 IU/g).The achievement of a high nattokinase activity using apple pomace, a low-cost industrial and agricultural waste as fermentation substrate demonstrates obvious economic advantages.

Key words：apple pomace；nattokinase；solid-state fermentation；process optimization

我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國，占世界總產(chǎn)量的1/3以上[1]。隨著蘋果產(chǎn)量的增加，果品深加工所帶來的每年幾百萬噸蘋果廢渣的處置問題長期以來未得到有效解決，造成了資源的巨大浪費，同時也帶來了嚴重的環(huán)境問題[2]。蘋果渣富含碳水化合物等有機物質(zhì)，是飼料、發(fā)酵工業(yè)、固態(tài)培養(yǎng)基等的良好原料。國內(nèi)外在用蘋果渣制備果膠、生產(chǎn)檸檬酸、做食用菌培養(yǎng)基質(zhì)等方面均進行了深度開發(fā)[3-4]，但對以蘋果渣為原料進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的研究還未見報道。

納豆是日本的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，早在2000多年前，就已為日本人所食用，并用來治療和預(yù)防心血管疾病[5]。1987年，日本須見洋行博士從納豆中提取出一種具有溶栓功能的絲氨酸蛋白酶，并定名為納豆激酶(nattokinase，NK)[6]。NK是一種治療心腦血管疾病的理想候選藥物。與其他傳統(tǒng)溶栓劑相比，具有安全性好、成本低、易被人體吸收、作用直接迅速、作用持續(xù)時間長等優(yōu)點[5]。同時NK作為功能性食品、食品添加劑和普通食品的發(fā)展也很迅速，其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)已經(jīng)成為世界各國研究的一個熱點[7]。

本研究采用響應(yīng)面設(shè)計的方法對NK固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，并對優(yōu)化后的結(jié)果進行驗證，為實現(xiàn)其工業(yè)化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣購自徐州某果品廠。

凝血酶(酶活力190BP)、尿激酶(酶活力1280U) 中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原 北京拜爾迪生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌DU115，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物研究室篩選并保存。

斜面培養(yǎng)基(按質(zhì)量分數(shù)配制)：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%、瓊脂2%；種子培養(yǎng)基(按質(zhì)量分數(shù)配制)：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(組分占干蘋果渣質(zhì)量的質(zhì)量分數(shù))：蘋果渣35g、麩皮20%、尿素1.5%、氧化鈣2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、水120mL。

1.3 蘋果渣固態(tài)發(fā)酵工藝

1.3.1 菌種活化

將經(jīng)斜面活化的菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，37℃、120r/min，恒溫培養(yǎng)24h。

1.3.2 工藝流程

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基在高壓鍋內(nèi)121℃條件下蒸煮20min，自然冷卻至55℃以下。在無菌條件下，將事先活化好的菌液噴灑于蘋果渣中攪拌均勻，于淺盤中鋪成3～5cm的薄層，37℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵24h[8-9]。發(fā)酵結(jié)束后取樣分析。

1.4 粗酶液制備及酶比活力測定

綜合有關(guān)NK測定的纖維蛋白平板法，略有改動，測定方法參見文獻[10-11]。

纖維蛋白平板的制作：配制0.8%的瓊脂糖溶液，煮沸10min，于55～60℃水浴中保溫30min；配制0.8mg/mL纖維蛋白原溶液，45℃水浴保溫20min。將7.5BP/mL凝血酶1mL與纖維蛋白原溶液和瓊脂糖溶液同時混合，立即倒平板，待凝固后即為纖維蛋白平板，點樣梯度濃度的尿激酶標(biāo)準品，37℃恒溫孵育18h，測其溶解圈直徑，溶解圈垂直直徑乘積對數(shù)與酶比活力對數(shù)呈線性相關(guān)。根據(jù)待測樣品的溶解圈面積大小計算出待測樣品相當(dāng)于尿激酶的活力單位，以表示待測樣品的酶產(chǎn)率。

尿激酶標(biāo)準曲線的測定：配制100、200、300、400、500IU/mL的尿激酶標(biāo)準溶液。取以上各濃度的尿激酶標(biāo)準溶液10μL點樣于纖維蛋白平板的濾紙片上，37℃培養(yǎng)18h，游標(biāo)卡尺測量溶解圈的兩垂直直徑。以溶解圈垂直直徑的乘積的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，尿激酶濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，做尿激酶標(biāo)準曲線。

粗酶液制備及點樣：將發(fā)酵后蘋果渣與0.85g/100mL的生理鹽水按1:10(m/V)的比例混合，浸提1h，充分洗脫蘋果渣中可溶性物質(zhì)，然后將洗脫液于6000r/min離心10min，取上清液即所需的粗酶液[12]。

取10μL樣品點樣于纖維蛋白平板的濾紙片上，37℃培養(yǎng)18h，游標(biāo)卡尺測量溶解圈的兩垂直直徑。參照尿激酶標(biāo)準曲線的方程計算樣品的酶產(chǎn)率。

圖1 納豆激酶標(biāo)準曲線Fig.1 Nattokinase standard curve

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計方法[13-16]，對尿素添加量、培養(yǎng)基加水量和氧化鈣添加量3個因素按照響應(yīng)面試驗設(shè)計，以NK的酶產(chǎn)率為指標(biāo)進行優(yōu)化，所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩皮添加量對產(chǎn)酶的影響

以干蘋果渣為基準，加入麩皮作為碳源，尿素1.5%、氧化鈣2%、培養(yǎng)基加水量120mL、接種量11%，37℃培養(yǎng)24h，用纖維蛋白平板法測定納豆激酶比活力，比較添加不同添加量的麩皮對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 麩皮添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of wheat bran amount on nattokinase yield

由圖2可知，添加麩皮有利于微生物產(chǎn)酶。因為麩皮除含有淀粉等碳水化合物以外，還含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，它們是微生物必需的生長因子。同時麩皮還是一種很好的膨松劑，保證了培養(yǎng)基內(nèi)空氣交換和熱量散發(fā)，從而有利于納豆芽孢桿菌代謝及納豆激酶的生成?？梢姡熎ぬ砑恿吭?0%時酶產(chǎn)率最高。

2.2 尿素添加量對產(chǎn)酶的影響

以干蘋果渣為基準，加入尿素作為氮源，麩皮10%、氧化鈣2%、培養(yǎng)基加水量120mL、接種量11%，37℃培養(yǎng)24h，用纖維蛋白平板法測定納豆激酶比活力，比較尿素添加量對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 尿素添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of urea concentration on nattokinase yield

由圖3可知，尿素添加量由0%變化到2.5%，NK酶產(chǎn)率逐漸上升，增加趨勢明顯；當(dāng)達到2.5%～4%時，酶產(chǎn)率逐漸下降。一方面采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白，需要保持較高的氮濃度，以促使微生物盡可能的利用無機氮合成蛋白質(zhì)，另一方面過量的尿素會抑制菌體的生長，導(dǎo)致酶產(chǎn)率下降。綜合考慮確定尿素添加量為2.5%。

2.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

以液體種子進行接種量試驗，麩皮10%，尿素2.5%，氧化鈣2%，培養(yǎng)基加水量120mL，37℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum size on nattokinase yield

由圖4可知，接種量為9%時，其酶產(chǎn)率最高。這說明接種量為3%～7%時由于菌體細胞量少，酶產(chǎn)率也相應(yīng)比較低；接種量為11%、13%時，菌體細胞量太多，在菌體生長期營養(yǎng)物質(zhì)消耗很快，到產(chǎn)酶期營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低，不利于菌體產(chǎn)酶。所以采取9%的接種量較為合適。

2.4 培養(yǎng)基加水量對產(chǎn)酶的影響

圖5 培養(yǎng)基加水量對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of water amount on nattokinase yield

以干蘋果渣為發(fā)酵基質(zhì)，分別加入60、80、100、120、140、160、180mL的水，麩皮10%、尿素2.5%、氧化鈣2%、接種量9%，37℃培養(yǎng)24h，比較培養(yǎng)基不同加水量對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見圖5。

由圖5可知，最適加水量為80mL。固態(tài)發(fā)酵中，培養(yǎng)基含水量要合適，固態(tài)發(fā)酵含水量過低，影響營養(yǎng)基質(zhì)的溶解和傳遞以及顆粒的潤脹等條件，不利于細胞生長。加水量過高不利于通氣，使基質(zhì)成團，影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，導(dǎo)致酶產(chǎn)率下降。

2.5 氧化鈣添加量對產(chǎn)酶的影響

用添加氧化鈣調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，以干蘋果渣為基準，分別加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的氧化鈣，測得相應(yīng)初始pH值約為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在麩皮10%、尿素2.5%、培養(yǎng)基加水量80mL、接種量9%，37℃培養(yǎng)24h的條件下，比較氧化鈣不同添加量對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 氧化鈣添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of calcium oxide concentration on nattokinase yield

由圖6可知，氧化鈣添加量2.5%，pH值約為7.5時酶產(chǎn)率最高。pH值對微生物的發(fā)酵和生長起著關(guān)鍵的作用，通過改變其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力來影響正常的生長代謝。納豆芽孢桿菌生長最適pH值是7.0～7.5，過低或過高的pH值都將影響其正常的生長狀態(tài)，導(dǎo)致酶產(chǎn)率下降。

2.6 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

分別添加麩皮10%，尿素2.5%，氧化鈣2.5%，培養(yǎng)基加水量80mL，接種量9%，將蘋果渣培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，每隔12h取樣1次，測定NK酶產(chǎn)率，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on nattokinase yield

由圖7可知，發(fā)酵時間對酶產(chǎn)率影響不大，36h酶產(chǎn)率最高。但考慮到生長周期越長，成本越大，也越容易滋生雜菌，發(fā)酵24h為合適的發(fā)酵時間。

2.7 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對固態(tài)發(fā)酵影響較為顯著的因素進行優(yōu)化，設(shè)定尿素添加量在2%～3%之間，培養(yǎng)基加水量在60～100mL之間，氧化鈣添加量在2%～3%之間，經(jīng)軟件Design Expert 7.0設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平，試驗結(jié)果見表1、2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平和編碼Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and experimental results

通過軟件設(shè)計，分析可以得到優(yōu)化后的響應(yīng)值的動態(tài)參數(shù)方程：

2.7.1 回歸分析

F檢驗反映的是回歸模型的有效性，包括失擬性檢驗和回歸方程顯著性檢驗。t檢驗是對回歸模型的系數(shù)進行顯著性檢驗。由方差分析可見，該模型的P＝0.0006＜0.05，表明模型方程顯著；失擬項在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.9359＞0.05)。該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2＝0.9558，說明建立的模型能理解響應(yīng)值變化的95.58%，模型擬合程度較好，模型是合適的，能比較準確地描述蘋果渣固態(tài)發(fā)酵中NK酶產(chǎn)率的變化規(guī)律。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression equation

從表3可見，A2、B2、C2對蘋果渣固體發(fā)酵NK酶產(chǎn)率影響極顯著(P＜0.01)；因素B、C對其影響顯著，AB交互作用對其影響顯著(P＜0.05)；AC、BC交互作用對其影響不顯著(P＞0.05)。

2.7.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖8 尿素添加量與培養(yǎng)基加水量交互作用對NK酶產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots describing the interactive effects of urea concentration and water amount on nattokinase yield

圖9 尿素與氧化鈣添加量交互作用對NK酶產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots describing the interactive effects of urea and calcium oxide concentrations on nattokinase yield

圖10 培養(yǎng)基加水量與氧化鈣添加量交互作用對NK酶產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots describing the interactive effects of water amount and calcium oxide concentration on nattokinase yield

從圖8～10可以看出，交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可直觀反映出來，等高線的形狀反映了交互作用的強弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[17]。在交互項對酶產(chǎn)率的影響中，尿素添加量與培養(yǎng)基加水量的交互作用較為顯著。

2.7.3 回歸模型的驗證實驗

經(jīng)過軟件Design Expert 7.0優(yōu)化，分析得到最佳試驗參數(shù)為尿素添加量2.58%、培養(yǎng)基加水量84.06mL、氧化鈣添加量2.65%，進行驗證實驗，重復(fù)3次。在該條件下實際最大值為2150IU/g，與理論預(yù)測最大值2181.9IU/g基本相符，表明該模型具有很好的可靠性和重現(xiàn)性，從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化的有效性。

3 結(jié) 論

本實驗通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計方法，對影響NK酶產(chǎn)率的尿素添加量、培養(yǎng)基加水量、氧化鈣添加量3個因素進行研究，結(jié)果顯示3因素對酶產(chǎn)率的影響作用是顯著的。利用統(tǒng)計學(xué)方法建立了提高蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)NK酶產(chǎn)率的二次多項式模型，作為推測三因素以及三者的交互作用對菌種發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的適宜方法。確定最佳發(fā)酵條件為尿素添加量2.58%、培養(yǎng)基加水量84.06mL、氧化鈣添加量2.65%，此條件下的納豆激酶產(chǎn)率為2150IU/g，比單因素試驗最高酶活1680IU/g提高了27.98%，結(jié)果證實是完全可行的，以廉價的工農(nóng)業(yè)廢料作為基本培養(yǎng)基獲得了有較高酶活的產(chǎn)品，經(jīng)濟優(yōu)勢明顯。

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Optimization of Fermentation Conditions for Nattokinase Production in Solid-state Fermentation by Bacillus subtilis Natto Using Apple Pomace as Substrate

CANG Yi-peng1，ZHANG Hong-zhi2，DONG Ming-sheng2,*
(1. Suqian Product Quality Supervision and Testing Institute, Suqian 223800, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)15-0181-06

2010-04-19

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目(CX(08)113)

倉義鵬(1974—)，男，碩士， 研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：yipengcang@163.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn