冀照君，孫 波*，遲玉杰，徐 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

方波脈沖電穿孔法提高酵母菌細(xì)胞通透性的條件優(yōu)化

冀照君，孫 波*，遲玉杰，徐 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了采用電穿孔法提高酵母菌細(xì)胞的通透性，將通過離心得到的酵母菌制成1×108CFU/mL的菌懸液，采用不同的方波電脈沖條件對(duì)其進(jìn)行處理。結(jié)果表明：在0.6mol/L的蔗糖等滲電脈沖介質(zhì)中，當(dāng)酵母菌細(xì)胞的處理?xiàng)l件為電場(chǎng)強(qiáng)度7kV/cm，脈沖寬度50μs，脈沖數(shù)14，間隔時(shí)間2s時(shí)，細(xì)胞的存活率平均為81.16%，電穿孔率平均為65.14%。這表明電穿孔法可以有效增強(qiáng)酵母菌細(xì)胞的通透性。

方波脈沖；電穿孔法；酵母菌；通透性

Abstract ：Yeast (Saccharomyces cerevisiae CICC 1012) cells were statically cultured in YEPD medium at 30 ℃ for 24 h and then separated by centrifugation at 3000 r/min after the end of culture and suspended in an electric pulse medium (containing sucrose, Tris-HCl and MgCl2, at pH 7.5) at a cell concentration of 1×108CFU/mL before square-wave electric pulse treatment under different operating conditions. Electric field strength of 7 kV/cm, pulse duration of 50μs, pulse number of 14, time interval of 2 s, and sucrose concentration of 0.6 mol/L were found optimum. The percentage survival of yeast cells was 81.16% and the percentage of electroporated yeast cells was 65.14% under these optimum conditions. This study suggests that the permeability of yeast cells can be increased by square-wave electroporation.

Key words：square-wave electric pulse；electroporation；yeast；permeability

電穿孔是一種利用電脈沖克服細(xì)胞膜屏障的過程[1]。即在電場(chǎng)作用下，細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時(shí)孔洞[2]，細(xì)胞膜的通透性和膜電導(dǎo)瞬時(shí)增大，使正常情況下不能通過細(xì)胞膜的分子(如親水分子、病毒顆粒、DNA、蛋白質(zhì)以及染料顆粒等)得以進(jìn)出細(xì)胞的一個(gè)生物物理過程[3-4]。電場(chǎng)造成細(xì)胞的電穿孔有兩種形式：可逆電穿孔和不可逆電穿孔[5-6]。如果脈沖條件不超過某一臨界限度，這種通透性是可逆的，否則細(xì)胞可以遭到不可逆的損傷或死亡[7-8]。由于該技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、高效[9]，目前己廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、基因工程、臨床醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域[10]。

目前，關(guān)于電穿孔在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增加細(xì)胞通透性等方面的應(yīng)用研究越來越多。研究者們利用適當(dāng)?shù)碾姶┛讞l件可以達(dá)到提高轉(zhuǎn)化效率或者細(xì)胞通透特性等目的。Suga等[5]的研究結(jié)果表明，裂殖酵母的最佳轉(zhuǎn)化電場(chǎng)強(qiáng)度為7.5～12.5kV/cm。Shirakashi等[11]采用流式細(xì)胞儀直接定量測(cè)定了細(xì)胞對(duì)大分子的富集量。肖華娟等[4]采用肝癌細(xì)胞HePG2作為靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度或脈沖寬度的增加，細(xì)胞膜穿孔率相應(yīng)增強(qiáng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜電穿孔具有累積效應(yīng)。汪和睦等[12]確定了橢圓釀酒酵母AS2-607(南陽(yáng)6號(hào)“K”)質(zhì)膜的電穿孔條件為RC脈沖電場(chǎng)，幅度5～10kV/cm，脈沖的時(shí)間常數(shù)小于30μm。但關(guān)于用方波脈沖對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行電穿孔以增加其通透特性的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬采用不同的電脈沖條件對(duì)酵母菌進(jìn)行處理，在保證酵母菌細(xì)胞存活率較高的情況下，盡量增加細(xì)胞的通透特性，以確定最適的電穿孔條件。以為進(jìn)行更深入的研究(將藥物成分滲透到細(xì)胞內(nèi)[6]，激活細(xì)胞膜的傳輸因子，提高酶的活性來加快酵母菌細(xì)胞的代謝速率等)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC 1012)由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

蔗糖 北京金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；Tris 上?；瘜W(xué)試劑公司；MgCl2北京康普匯維科技有限公司；電脈沖介質(zhì)[13](270mmol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L MgCl2，pH7.5)。

YEPD(yeast extract peptone dextrose)液體擴(kuò)培培養(yǎng)基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，水1000mL，pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

ECM830型方波電穿孔儀、0.2cm樣品杯 美國(guó)BTX公司；AA-650型原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司；TDZ4臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體的收集

從斜面上挑取兩環(huán)酵母菌接入100mL 4°Bix麥芽汁中，30℃靜止培養(yǎng)24h，然后按照體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入YEPD液體擴(kuò)培培養(yǎng)基中，30℃靜止培養(yǎng)24h。3000r/min離心10min，收集菌體[14]。菌體用生理鹽水洗滌3次，然后用電脈沖介質(zhì)洗滌2次。

1.3.2 酵母菌懸浮液的準(zhǔn)備

將離心得到的菌體懸浮于電脈沖介質(zhì)中，使得酵母菌濃度為1×108CFU/mL[6]，置于冰浴中5min[15]。

1.3.3 酵母菌電脈沖處理

取0.4mL懸浮液于0.2cm的樣品杯中[15]，然后將樣品杯放于樣品池，調(diào)節(jié)電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖數(shù)和間隔時(shí)間，對(duì)酵母菌進(jìn)行電脈沖處理。

1.3.4 酵母菌細(xì)胞的掃描電鏡觀察

將電穿孔前后的酵母菌細(xì)胞進(jìn)行戊二醛固定，然后用不同體積分?jǐn)?shù)的梯度乙醇(30%、50%、70%、90%)各處理15min進(jìn)行脫水，最后用無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水兩次，于二氧化碳臨界點(diǎn)下冷凍干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.5 酵母菌存活率的測(cè)定

迅速取電脈沖處理后的菌懸液0.1mL于0.9mL生理鹽水中，冰浴5～10min，然后將其置于10～11℃保持40min[8]，進(jìn)行稀釋，涂布計(jì)數(shù)。分別計(jì)算電脈沖處理前后酵母菌的總數(shù)。

1.3.6 菌懸液鉀離子含量測(cè)定及酵母菌電穿孔率計(jì)算

電脈沖處理后，細(xì)胞立即移入冷凍的安剖管中，冰浴5～10min，然后將其置于10～11℃保持40min，使得細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的離子濃度平衡。菌懸液的鉀離子濃度采用原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，并作未進(jìn)行電脈沖處理的空白實(shí)驗(yàn)。鉀離子測(cè)定參數(shù)[16]見表1。

表1 鉀離子測(cè)定參數(shù)Table 1 Atomic absorption spectrometric parameters for K+determination

電穿孔率由式(2)計(jì)算：

式中：[K+]x為電脈沖后菌懸液的鉀離子含量；[K+]0%未進(jìn)行電脈沖處理菌懸液的鉀離子含量；[K+]100%細(xì)胞全部電穿孔后菌懸液的鉀離子含量[8]。為了得到[K+]100%，將電脈沖處理后的菌懸液4000r/min離心15min，測(cè)定離心后的鉀離子含量，當(dāng)離心后的鉀離子含量增加到最大并且不再變化時(shí)，所對(duì)應(yīng)離心前的最小鉀離子含量即為[K+]100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 電脈沖介質(zhì)中蔗糖濃度的確定

圖1 電脈沖介質(zhì)濃度對(duì)酵母菌細(xì)胞存活率和電穿孔率的影響Fig.1 Effects of sucrose concentration on the percentage survival of yeast cells and the percentage of electroporated yeast cells

在酵母菌細(xì)胞電脈沖過程中，電脈沖介質(zhì)的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素[5]。因此，首先確定出電脈沖介質(zhì)的滲透壓。在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇電脈沖介質(zhì)濃度為0.1～1.0mol/L，在電場(chǎng)強(qiáng)度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為12，間隔時(shí)間為2s的條件下，對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行電脈沖作用，分別測(cè)定細(xì)胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果見圖1。蔗糖濃度對(duì)電穿孔率影響較小，而對(duì)存活率的影響較大，當(dāng)蔗糖濃度小于0.5mol/L時(shí)，存活率較低，這是因?yàn)榈蜐B溶液中，細(xì)胞溶脹作用阻止了膜的正?；謴?fù)，引起膜不可逆的破壞。相反，高滲溶液(蔗糖濃度大于0.7mol/L以上)中細(xì)胞的存活率也下降，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)部水分的流動(dòng)而導(dǎo)致細(xì)胞收縮，這樣也增加了細(xì)胞膜的破壞。相比之下，等滲條件(蔗糖濃度為0.5～0.7mol/L)下，膜的恢復(fù)不會(huì)受到阻礙，細(xì)胞的存活率最高(79.4%～80.3%)，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外等滲平衡[5]。該濃度與張華山等[17]和趙悅茗等[18]研究酵母菌原生質(zhì)體穩(wěn)定劑的滲透壓結(jié)果一致。因此，下面確定脈沖條件的實(shí)驗(yàn)中所配制電脈沖介質(zhì)選擇蔗糖濃度為0.6mol/L的等滲溶液((0.6±0.1)mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L MgCl2、pH7.5，超純水配制)。

2.2 電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度對(duì)酵母菌細(xì)胞電穿孔通透性的影響

為了獲得酵母菌電穿孔的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度，分別將電場(chǎng)強(qiáng)度范圍設(shè)定為1～12kV/cm，脈沖寬度分別為10、30、50、70、90μs，脈沖數(shù)為12，間隔時(shí)間為2s，對(duì)酵母菌進(jìn)行電脈沖處理，測(cè)定電穿孔后酵母菌的存活率和電穿孔率，結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母菌細(xì)胞電穿孔率的影響Fig.2 Effect of electric field strength on the percentage of electroporated yeast cells

圖3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酵母菌細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of electric field strength on the percentage survival of yeast cells

由圖2、3可知，總體趨勢(shì)是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，酵母菌細(xì)胞的電穿孔率逐漸增大，存活率卻逐漸下降。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度小于4kV/cm時(shí)，即使增加脈沖寬度，酵母菌細(xì)胞的電穿孔率也僅僅達(dá)到13.9%，存活率始終接近于100%。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于4kV/cm以后，電穿孔率開始迅速增加，存活率開始緩慢下降，這種變化規(guī)律與Weaver等[19]的研究結(jié)果一致。

由于采用的脈沖寬度不同，所以電穿孔率和存活率的變化速率不同。脈沖寬度為10μs時(shí)，雖然細(xì)胞的存活率較高，但電穿孔率較低，最大也只能達(dá)到50.3%(此時(shí)的存活率只有69.8%)；相反，如果調(diào)節(jié)脈沖寬度為70μs或90μs時(shí)，細(xì)胞的電穿孔率上升較快，而存活率迅速下降。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在保證細(xì)胞存活率較高的同時(shí)，盡量增大電穿孔率，因此，選擇電場(chǎng)強(qiáng)度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，此時(shí)，酵母菌細(xì)胞的存活率為80.43%，電穿孔率為57.49%。

2.3 脈沖數(shù)對(duì)酵母菌細(xì)胞電穿孔通透性的影響

在電場(chǎng)強(qiáng)度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs的條件下，將脈沖數(shù)分別調(diào)節(jié)為2、4、6、8、10、12、14、16、18和20個(gè)，間隔時(shí)間為2s，對(duì)酵母菌進(jìn)行電脈沖處理，分別測(cè)定酵母菌細(xì)胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 脈沖數(shù)對(duì)酵母菌細(xì)胞存活率和電穿孔率的影響Fig.4 Effect of pulse number on the percentage survival of yeast cells and the percentage of electroporated yeast cells

由圖4可以看出，脈沖數(shù)對(duì)酵母菌的存活率影響較小，但對(duì)酵母菌的電穿孔率影響顯著。隨著脈沖數(shù)的增加，酵母菌細(xì)胞的存活率從96.4%下降到47.3%，電穿孔率從10.1%增大到98.8%。因此，選擇脈沖數(shù)為12～14時(shí)，酵母菌細(xì)胞的存活率較高。

2.4 正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究電脈沖條件的各因素對(duì)酵母菌細(xì)胞通透性的影響，在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖數(shù)為因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)定酵母菌細(xì)胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果如表2所示。各因素對(duì)細(xì)胞存活率和電穿孔率的影響順序均為：即電場(chǎng)強(qiáng)度＞脈沖寬度＞脈沖數(shù)。細(xì)胞的存活率和電穿孔率呈負(fù)相關(guān)性，但由于試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱吮ＷC細(xì)胞存活率較高的同時(shí)，盡量增大其電穿孔率，因此，綜合考慮正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇最適條件為：A2B2C3，即電場(chǎng)強(qiáng)度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為14。

表2 正交試驗(yàn)確定最適電脈沖條件Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing square-wave electric pulse treatment conditions

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為14，間隔時(shí)間為2s，在此條件下對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行電脈沖處理，酵母菌細(xì)胞的存活率平均為81.16%，電穿孔率平均為65.14%。這與Suga等[5]和Weaver等[19]的研究結(jié)果相近。

2.6 酵母菌細(xì)胞的電鏡觀察

為了直觀的描述方波脈沖對(duì)酵母菌細(xì)胞的電穿孔現(xiàn)象，采用掃描電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖5。

圖5 酵母菌細(xì)胞電穿孔前后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5 Scanning electron micrographs of yeast cells before and after electroporation

由圖5可以看出，電穿孔前的酵母菌細(xì)胞較完整，表面光滑且無(wú)雜物，而電穿孔后的酵母菌細(xì)胞表面粗糙，并且表面附有許多碎片，這可能是由于細(xì)胞通透性增加后，還沒來得及固定，可逆孔洞就開始復(fù)原，形成了非常粗糙的表面，這可以證明細(xì)胞的可逆電穿孔洞維持的時(shí)間極短，在幾秒內(nèi)就會(huì)復(fù)原。

3 討 論

酵母菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用日趨廣泛，其中釀酒酵母是較好的研究對(duì)象[20]。本研究最終確定了增強(qiáng)酵母菌細(xì)胞通透性的最佳電穿孔條件，結(jié)果表明電穿孔法可以有效改變酵母菌的通透性。

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度對(duì)酵母菌細(xì)胞存活率和電穿孔率的影響都較明顯，這是因?yàn)槭┘拥碾妶?chǎng)強(qiáng)度決定了細(xì)胞兩側(cè)電壓的大小，該電壓使細(xì)胞結(jié)構(gòu)瞬間變化，脈沖寬度的長(zhǎng)短決定了細(xì)胞是否出現(xiàn)微孔，并使之增大[21]。

當(dāng)脈沖寬度一定，細(xì)胞膜兩側(cè)電壓達(dá)到臨界跨膜電壓時(shí)，細(xì)胞才會(huì)發(fā)生電穿孔現(xiàn)象，如果電場(chǎng)強(qiáng)度較低，只有一些體積較大的細(xì)胞兩側(cè)積累的電荷才可以使細(xì)胞形成孔洞，大部分細(xì)胞還未能形成孔洞；如果電場(chǎng)強(qiáng)度太大，細(xì)胞兩側(cè)的電壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了臨界電壓，細(xì)胞上就會(huì)形成不可恢復(fù)的較大孔徑，細(xì)胞內(nèi)容物容易溶出，細(xì)胞死亡[22]。然而當(dāng)脈沖寬度較低時(shí)，細(xì)胞形成的孔洞會(huì)很快恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)離子還沒有來得及釋放，因此測(cè)得的鉀離子含量較小，即電穿孔率較小[23]；相反的，當(dāng)脈沖寬度較大時(shí)，細(xì)胞形成了較大的不可逆孔洞，致使細(xì)胞的存活率下降。因此，選擇合適的電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度對(duì)于酵母菌細(xì)胞微孔的形成非常重要。

脈沖數(shù)較低時(shí)，受到電場(chǎng)作用的細(xì)胞數(shù)較少，或形成非常微小的孔洞，并且該微孔恢復(fù)非常迅速，這些微孔對(duì)一些離子還具有選擇性[24]，如果要通過膜孔導(dǎo)入大分子或者DNA，則需要更大的孔徑[25]；當(dāng)脈沖數(shù)增加后，細(xì)胞受到電脈沖作用的次數(shù)增加，導(dǎo)致孔洞形成的數(shù)量在增加，加速了離子的流動(dòng)[25]；更多的脈沖數(shù)不僅增加了孔洞數(shù)，而且會(huì)使得已經(jīng)形成孔洞的細(xì)胞繼續(xù)受到電脈沖作用，細(xì)胞結(jié)構(gòu)來不及復(fù)原，并且多次作用后，細(xì)胞孔徑增大，容易形成不可逆的孔洞[22]。

電致孔洞的復(fù)原機(jī)制至今仍處于理論模型階段[26]。一般細(xì)胞電穿孔的可逆性和復(fù)原時(shí)間是由維持孔洞邊緣的能量來確定，如果維持孔洞邊緣的勢(shì)能比恢復(fù)雙分子層的勢(shì)能高，則孔洞就不穩(wěn)定，膜將很快復(fù)原，否則孔洞將繼續(xù)擴(kuò)大。實(shí)際細(xì)胞膜上孔洞的復(fù)原非常復(fù)雜，不單只與類脂分子的極性頭部的親水作用和碳?xì)滏湹姆兜氯A引力有關(guān)，還與膠體滲透作用、溶液離子作用和膜蛋白的影響等有關(guān)[21]，因此，電致孔洞的復(fù)原機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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Optimization of Square-wave Electroporation for Increasing the Permeability of Yeast Cells

JI Zhao-jun，SUN Bo*，CHI Yu-jie，XU Ning
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Q93.31

A

1002-6630(2010)15-0050-05

2009-11-23

黑龍江省“十一五”科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(GA06B402-86-6)

冀照君(1982—)，男，助教，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵。E-mail：jzj808@163.com

*通信作者：孫波(1964—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵。E-mail：bosun1962@163.com