于國萍，安 靜，韓宗元

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

熱處理及葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

于國萍，安 靜，韓宗元

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

探討熱處理以及葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯誘導(dǎo)的酸化作用對大豆分離蛋白凝膠特性的影響。結(jié)果表明：熱處理顯著提高大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度、表面疏水性、保水性。最佳工藝條件為：90℃加熱處理40min。大豆分離蛋白經(jīng)葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯誘導(dǎo)酸化后，形成熱處理凝膠的凝膠特性發(fā)生了顯著的變化。

熱處理；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯；誘導(dǎo)；大豆分離蛋白；凝膠

Abstract ：Soybean protein isolate (SPI) was heated for different periods of time at different temperatures in order to investigate the effects of length of heating time and heating temperature on the gel strength, surface hydrophobicity, water-holding capacity of SPI. Length of heating time of 40 min and heating temperature of 90 ℃ were found optimum. Along with this, glucono-δlactone-induced acidification on SPI was investigated, and the optimum induction time was found to be 6 h. Also, the effect of acidification induced by different concentrations of glucono-δ-lactone followed by heating treatment under optimized conditions on the gel strength, surface hydrophobicity, water-holding capacity of SPI was explored, and the results obtained showed that glucono-δ-lactone-induced acidification resulted in significant changes in these three characteristics of heated SPI.

Key words：heat treatment；glucono-δ-lactone；induce；soy protein isolate；gel

大豆蛋白不僅是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白源，同時在食品中具有許多功能性質(zhì)，如起泡性、乳化性、溶解性、凝膠性等。凝膠特性作為大豆蛋白產(chǎn)品的一個重要功能特性，直接影響著產(chǎn)品如豆制品和灌腸制品的品質(zhì)[1]。目前，我國開發(fā)的大豆分離蛋白產(chǎn)品主要是肉制品添加蛋白，即凝膠型分離蛋白[2]。

大豆分離蛋白(SPI)凝膠的形成過程和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受鹽濃度、pH值及溫度等因素的影響。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成是由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的相互作用平衡以及相鄰多肽鏈之間吸引力和排斥力共同作用的結(jié)果[3]。在熱誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠形成的過程中，涉及的分子作用力可能是氫鍵、疏水性相互作用，而維持凝膠結(jié)構(gòu)時可能的作用力是二硫鍵和氫鍵[4]。

葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(glucono-δ-lactone，簡稱GDL)是由葡萄糖氧化形成的葡萄糖酸環(huán)化而成，在水溶液中會緩慢水解成葡萄糖酸，并以葡萄糖酸及其δ內(nèi)酯和γ內(nèi)酯的平衡狀態(tài)存在。葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯作為凝固劑被廣泛應(yīng)用于大豆制品的加工過程中[5]。Koyama等[6]研究表明GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白(SPI)的凝膠作用是由于GDL中質(zhì)子降低了蛋白質(zhì)分子中負電荷基團間靜電斥力的結(jié)果。

本實驗以大豆分離蛋白為原料，研究溫度、加熱時間等熱處理條件以及GDL誘導(dǎo)酸化對大豆蛋白凝膠特性的影響，了解其變化規(guī)律，尋找其可能的變化機理，為改進我國大豆蛋白的功能性和應(yīng)用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白 哈高科大豆食品有限責任公司。

1-苯胺基萘-8-硝基苯甲酸鹽(ANS) 美國Sigma公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯 江西新黃海醫(yī)藥食品化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

TA-XT plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；HITACHI 650-60熒光分光光度計 日本島津公司；pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠；離心機 北京醫(yī)藥離心機廠。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白備用液的制備[7]

以一定量的大豆分離蛋白分散在100mL水中，室溫下，用磁力攪拌器攪拌2h。置于4℃冰箱過夜，備用。大豆分離蛋白最終質(zhì)量濃度為13g/100mL。

1.2.2 熱處理對大豆分離蛋白凝膠性的影響

1.2.2.1 加熱溫度對大豆分離蛋白凝膠性的影響

將50mL大豆分離蛋白備用液加入100mL燒杯中，用保鮮膜封口，在60、70、80、90、100℃條件下，水浴40min。然后，用冰水浴將凝膠迅速冷卻至室溫。最后，將樣品置于4℃冰箱過夜[8]，用于凝膠性質(zhì)的測定。

1.2.2.2 加熱時間對大豆分離蛋白凝膠性的影響

將50mL的大豆分離蛋白備用液加入100mL燒杯中，用保鮮膜封口，在90℃條件下，水浴10、20、30、40、50min。然后，用冰水浴將凝膠迅速冷卻至室溫。最后，將樣品置于4℃冰箱過夜，用于凝膠性質(zhì)的測定。

1.2.3 葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠性的影響

1.2.3.1 GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白的酸化程度的判定[7]

取大豆分離蛋白備用液6份，加入葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)，使其終質(zhì)量濃度分別為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8g/100mL。由于GDL具有酸化作用，因此在不同的時間間隔內(nèi)對樣品pH值進行測定，確定酸化時間。

1.2.3.2 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠性的影響

取大豆分離蛋白備用液7份，加入葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)，使其終濃度分別0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8g/100mL。室溫下，用磁力攪拌器緩慢的攪拌至酸化時間(6h)。然后將GDL-誘導(dǎo)的大豆分離蛋白在90℃加熱40min，然后，用冰水浴將凝膠迅速冷卻至室溫。最后，將樣品置于4℃冰箱過夜，制成GDL-誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠(以GDL添加量為0時的凝膠，為對照)。用于凝膠性質(zhì)的測定。

1.2.4 大豆分離蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)分析

依據(jù)Gu等[7]蛋白凝膠的檢測方法，略有改動。樣品測定前在室溫下陳化1h即可測定。凝膠大小約為50mm×25mm。采用P/0.5柱形探頭， 設(shè)定前進速度：10mm/s，沖壓速度：10mm/s；后撤速度：10mm/s，沖壓深度：10mm；一次測定過程中探頭下壓兩次。每個樣品重復(fù)3次測定過程，取平均值，得凝膠質(zhì)構(gòu)參數(shù)。

1.2.5 大豆分離蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)測定[8-9]

取一塊加熱后的大豆分離蛋白凝膠，加入到0.01mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液中，在室溫下，用磁力攪拌器緩慢的攪拌2h。然后，將處理過的樣品在9000r/min條件下離心15min。取上清液備用。采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)熒光探針法，對大豆分離蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)進行測定，具體方法見文獻[9]。

1.2.6 大豆分離蛋白凝膠的保水性測定[7]

依據(jù)Gu等[7]蛋白凝膠保水性的檢測方法，略有改動。大豆蛋白凝膠在9000r/min條件下離心20min。保水性(WHC)公式如下：

式中：mt為凝膠樣品中所含水分的總質(zhì)量/g；mr為離心后凝膠溢出水分的質(zhì)量/g。

1.2.7 統(tǒng)計分析

每次實驗重復(fù)3次。所用數(shù)據(jù)均為3次的平均值，誤差項為標準差；數(shù)據(jù)標注字母不同者為差異顯著(P＜0.05)。數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對大豆分離蛋白凝膠性的影響

2.1.1 熱處理對大豆分離凝膠強度的影響

圖1 溫度(A)和加熱時間(B)對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.1 Effect of temperature(A) and heating time(B) on strength of SPI gel

由圖1可知，溫度在60～90℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，凝膠強度顯著升高；直到90℃，凝膠強度達到最大；當溫度繼續(xù)升高，凝膠強度顯著下降。加熱時間在10～40min范圍內(nèi)，隨加熱時間的增加，凝膠強度顯著增加；直到40min，凝膠強度達到最大；當加熱時間繼續(xù)增加，凝膠強度變化不顯著。

Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱處理的蛋白溶液主要由三部分組成，即聚集體、中間體及未聚集部分。從凝膠形成的過程考慮，熱誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠的形成與聚集體百分含量及粒徑大小有關(guān)。隨著溶液質(zhì)量濃度的不斷升高，聚集體特性不斷增強，其粒徑亦不斷增大。具有較大體積和開放性結(jié)構(gòu)的聚集體為交聯(lián)提供更多的相互作用位點，使得凝膠強度增加。

2.1.2 熱處理對大豆分離凝膠表面疏水性的影響

圖2 溫度(A)和加熱時間(B)對大豆分離蛋白凝膠表面疏水性的影響Fig.2 Effect of temperature(A) and heating time(B) on surface hydrophobicity of SPI gel

由圖2可知，溫度在60～70℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，凝膠表面疏水性指數(shù)變化不顯著；直到80℃，凝膠表面疏水性指數(shù)顯著增加，并達到最大；當溫度繼續(xù)升高，凝膠表面疏水性指數(shù)變化不顯著。加熱時間在10～50min范圍內(nèi)，隨加熱時間的增加，凝膠表面疏水性指數(shù)變化不顯著。

大豆蛋白在熱處理過程中的變化是復(fù)雜的，因為它們在中性條件下含有可溶性的寡聚體[8]。寡聚蛋白的熱變性過程可分為兩個階段：1)寡聚體結(jié)構(gòu)的破壞，2)實際存在的單體變性，開始聚集。球蛋白的變性包括蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的破壞，多肽鏈的展開以及疏水部位的暴露[11]。表面疏水性的增加是由于聚集體解離引起的疏水區(qū)域的增多[12]。Campbell等[8]也報道了大豆蛋白聚集體的存在，在中性條件下，盡管這些低聚體變性了，但是這些低聚體仍然是可溶的。這些報導(dǎo)都解釋了疏水性增加這一事實。

2.1.3 熱處理對大豆分離凝膠保水性的影響

圖3 溫度(A)和加熱時間(B)對大豆分離蛋白凝膠保水性的影響Fig. 3 Effect of temperature(A) and heating time(B) on water-holding capacity of SPI gel

由圖3可知，未經(jīng)熱處理的大豆分離蛋白的保水性是(65.88±1.08)%，溫度在60～100℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，凝膠保水性在96.78%～98.74%的范圍內(nèi)，變化不顯著。加熱時間在10～50min范圍內(nèi)，隨加熱時間的增加，凝膠保水性變化不顯著。但是，同未經(jīng)加熱處理的大豆分離蛋白相比，熱處理顯著增加了大豆分離蛋白凝膠的保水性。

大豆分離蛋白加熱后形成的凝膠，具有很好的保水性?？赡苁且驗椋河捎跓崽幚恚鸬鞍兹芙舛冉档秃投蜴I增加，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的加強和凝膠“鎖水能力”的增強[8]。保水性的增加也歸因于SPI變性程度的增加[12]。另外，凝膠中持水的數(shù)量也和凝膠內(nèi)部的孔徑大小有關(guān)[8]。

2.2 葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠性的影響

2.2.1 GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白的酸化程度的判定

未添加GDL時，大豆分離蛋白pH值為7.30。由圖4可知，隨著GDL添加量的增加，GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白的pH值降低，隨作用時間的增加，樣品的pH值也不斷下降，在6h后，6個樣品的pH值分別穩(wěn)定在5.72、5.10、4.70、4.33、4.08、3.88，24h后，pH值僅繼續(xù)降低了0.2。由此表明：SPI體系的pH值在6h已基本穩(wěn)定，因此選擇GDL的誘導(dǎo)時間是6h。

圖4 GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白酸化程度的判定Fig.4 Identification of acidification degree for GDL-induced SPI

2.2.2 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

圖5 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.5 Effect of GDL induction on strength of SPI gel

由圖5可知，GDL-誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠，與對照凝膠(pH7.30)相比，凝膠強度顯著下降。其中當GDL添加量為2.4g/100mL(pH4.70)和3.2g/100mL(pH4.33)，即在蛋白等電點附近時，凝膠強度最低。

GDL誘導(dǎo)大豆分離蛋白的凝膠作用是由于GDL中質(zhì)子降低了蛋白質(zhì)分子中負電荷基團之間的靜電斥力的結(jié)果[6]。在蛋白等電點(pH4～5)時，靜電斥力達到最小值，此時靜電荷為零。疏水相互作用引起的變性蛋白的聚集會由于沒有了靜電斥力的穩(wěn)定作用而增強[8]。蛋白溶解度在等電點是最低的，張紅娟等[13]研究表明：11S 球蛋白在pH4.4～6.4 等電點范圍也無法形成凝膠，而是蛋白質(zhì)顆粒的聚集，上層析出大量的水。當pH值高于5和低于4時，溶解度都會增加[14]，GDL誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠強度加大。

2.2.3 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠表面疏水性的影響

由圖6可知，GDL添加量在0～2.4g/100mL的范圍內(nèi)，隨GDL添加量的增加，GDL-誘導(dǎo)凝膠的表面疏水性指數(shù)顯著下降；其中GDL添加量為1.6g/100mL(pH5.10)時，GDL-誘導(dǎo)凝膠的表面疏水性指數(shù)達到最低；之后，隨GDL添加量的繼續(xù)增加，GDL-誘導(dǎo)凝膠的表面疏水性指數(shù)顯著增加。直到GDL添加量為4.8g/100mL(pH3.88)時，GDL-誘導(dǎo)凝膠的表面疏水性指數(shù)高于對照凝膠(pH7.30)。

在酸性pH3.8～4.5條件下，對天然的大豆分離蛋白加熱，會導(dǎo)致大多數(shù)蛋白質(zhì)變得不溶解[8,14]，蛋白溶解度在等電點時最低。在GDL添加量為1.6g/100mL和2.4g/100mL時，pH值分別為5.10和4.70，接近大豆分離蛋白等電點，溶解性較低，故凝膠的表面疏水性指數(shù)相對較低。

圖6 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠表面疏水性的影響Fig.6 Effect of GDL induction on surface hydrophobicity of SPI gel

2.2.4 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠保水性的影響

圖7 GDL-誘導(dǎo)對大豆分離蛋白凝膠保水性的影響Fig.7 Effect of GDL induction on water-holding capacity of SPI gel

由圖7可知，GDL-誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠，與對照凝膠(pH7.30)比，保水性顯著下降。隨GDL添加量的增加，GDL-誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠的保水性變化不顯著。與對照相比，GDL誘導(dǎo)的SPI熱凝膠的保水性下降。這種現(xiàn)象證明了Penkema的報道：與中性pH值下形成的凝膠比，酸性pH值下形成的凝膠結(jié)構(gòu)更粗糙，導(dǎo)致其滲透性增強，保水性下降[15]。

據(jù)報道：對于SPI溶液，不溶性蛋白成分、—SH、保水性之間存在關(guān)聯(lián)性[8,12]。GDL誘導(dǎo)的SPI熱凝膠也存在同樣的關(guān)聯(lián)性[8]。

Campbell等[8]研究表明：在中性條件下加熱SPI會導(dǎo)致大的聚合體形成，而這些聚合體在被GDL酸化時，與天然存在的蛋白共沉淀，因此，形成了更大的聚合體。 在低pH值條件下，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)由不溶性蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中還涉及到疏水相互作用和二硫鍵的形成。

3 結(jié) 論

熱處理能夠顯著提高大豆分離蛋白的凝膠特性，其凝膠強度、表明疏水性、保水性均有所提高。最佳條件為：90℃加熱處理40min。

由于葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯誘導(dǎo)的酸化作用，大豆分離蛋白體系的pH值不斷降低。當GDL誘導(dǎo)的時間是6h時，pH值基本恒定，SPI體系穩(wěn)定。因此選擇的GDL誘導(dǎo)的時間是6h。

大豆分離蛋白經(jīng)質(zhì)量濃度為0～4.8g/100mL的葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯誘導(dǎo)酸化后，形成的熱處理凝膠的凝膠特性發(fā)生了顯著的變化。凝膠強度均有所下降；疏水性呈現(xiàn)出趨勢性變化；保水性由97.83%下降到43.68%。

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Effects of Heating Treatment and Glucono-δ-lactone-induced Acidification on the Gel Properties of Soybean Protein Isolate

YU Guo-ping，AN Jing，HAN Zong-yuan
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Q816

A

1002-6630(2010)15-0021-05

2009-12-02

國家“863”計劃項目(2006AA10Z322)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項基金項目(2006RFQXN014)

于國萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com