武晉榮，趙和平

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西太原 030001）

康萊特（KLT）注射液是從傳統(tǒng)中藥薏苡仁中提取的新型雙相廣譜中藥抗腫瘤藥物，臨床上多用其靜脈乳劑，研究表明[1-2]，KLT 具有阻滯腫瘤細(xì)胞有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，影響癌基因表達(dá)，抑制腫瘤新生血管生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平以及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等作用，而且能明顯改善患者的生存質(zhì)量[3-4]。目前KLT 對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6 抗腫瘤作用的機(jī)制還缺少全面的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在分析康萊特是否是通過抑制Hepa1-6 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑瘤作用，為其在臨床應(yīng)用中提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 康萊特注射液（100 ml/瓶，浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z10970091）；DMEM 培養(yǎng)液為Invitrogen 公司產(chǎn)品，小牛血清、胰蛋白酶及噻唑蘭（MTT）均購自武漢博士德生物工程有限公司；青霉素、鏈霉素為HyClone公司產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）：天津市化學(xué)試劑公司。

1.1.2 主要儀器 ZS-2 板式酶標(biāo)儀（中國(guó)航天工業(yè)總公司），SWCJ-FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，普通臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠Hepa1-6 肝癌細(xì)胞株購于中國(guó)農(nóng)科院細(xì)胞庫，以含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔天換液一次，3～4d 傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞稀釋為1×105/ml 密度每孔200 μl 移入 96 孔培養(yǎng)板中。 加入 KLT 組 B（10 ml/L）、C（20 ml/L）、D（30 ml/L）、E（40 ml/L）、F（50 ml/L）的 10%胎牛血清dMEM培養(yǎng)液。另設(shè)A 組（空白對(duì)照組，10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液）。分別培養(yǎng)24、48、72 h， 實(shí)驗(yàn)終止4h 前加入MTT 液（5 mg/ml）20 μl。 棄上清，加入dMSO 150 μl，振蕩 10 min 使結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定吸光度（OD）值，重復(fù)3次取平均值。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：抑制率（IC）=（空白對(duì)照組OD 均值-用藥組OD 均值）/空白對(duì)照組OD 均值×100%。

1.4 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變傳代試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞稀釋為1×105/ml 密度每孔1 ml 接種于放有蓋玻片的6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為四組，分別加入 KLT（B、D、F），并設(shè) A 組作為對(duì)照（每孔總液量均為2 ml），培養(yǎng)48h 后取出覆蓋有細(xì)胞的蓋玻片，PBS 洗3次，浸入40g/L 多聚甲醛中固定15 min，PBS 洗2次， 常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液置6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24h 后棄上清，加入 KLT（B、D、F），每種濃度設(shè)平行4孔（即每種濃度重復(fù)4次），并設(shè)A 組作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入0.25%的胰酶1 ml 將細(xì)胞消化，置入離心管中，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清；PBS洗2次，離心、棄上清，加70%無水乙醇2 ml 固定，振蕩混勻，離心，棄上清，過300 目篩子，PBS 洗3次，加入1 ml PI工作液，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，采用單因素方差分析及 LSD-t 檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLT對(duì)Hepa1-6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

Hepa1-6 細(xì)胞在KLT 不同劑量、時(shí)間作用后，MTT 法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況結(jié)果示：隨著KLT劑量的逐漸增加、作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸增加。各給藥組與A 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；各給藥組組間比較示：與 B 組比較，C 組與 B 組（P>0.05），D 組與 B 組（P<0.01）；與d 組比較，E 組與d 組（P>0.05），F(xiàn) 組與d 組（P<0.01）。 提示，KLT 對(duì)Hepa1-6 細(xì)胞的抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；并且KLT 以10、30、50 ml/L 作用時(shí)，細(xì)胞抑制率顯著，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用此三種濃度進(jìn)行。見圖1。

2.2 KLT對(duì)Hepa1-6細(xì)胞形態(tài)及傳代試驗(yàn)的影響

光鏡示，Hepa1-6 胞質(zhì)呈粉紅色，胞核呈深藍(lán)色。A 組細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或三角形，偽足多、長(zhǎng)，滿視野瘤巨細(xì)胞及核分裂相。隨著給藥濃度增加，細(xì)胞偽足漸回縮，細(xì)胞形態(tài)變小、圓，細(xì)胞輪廓清晰度增強(qiáng)，排列松散或聚集成團(tuán)，細(xì)胞分裂相漸減少，瘤巨細(xì)胞漸減少。傳代試驗(yàn)表明，A 組細(xì)胞生長(zhǎng)快，分裂增殖旺盛，3～4d 傳代一次，隨著給藥濃度增加，傳代能力逐漸下降且失去傳代能力，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象。上述現(xiàn)象表明，細(xì)胞形態(tài)及傳代試驗(yàn)與藥物濃度呈依賴性，見圖2。

2.3 KLT對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡的影響

不同劑量KLT 作用Hepa1-6 肝癌細(xì)胞48h 后， 均在G0/G1期前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，且該峰隨著KLT 作用濃度的增高而升高（圖 3）。 經(jīng) KLT（B、D、F）作用 48h 后，細(xì)胞凋亡率分別為（7.86±0.40）%、（12.34±1.09）%和（28.67±0.85）%，而對(duì)照組僅為（2.88±0.30）%，各藥物組與對(duì)照組比較、各藥物組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。

3 討論

原發(fā)性肝癌系全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，且近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)[5]。目前臨床治療肝癌仍以手術(shù)、放療、化療為主，但70%～80%的患者就診時(shí)已失去手術(shù)最佳時(shí)期。臨床常用的西藥化療物雖有很強(qiáng)的癌細(xì)胞殺傷性，但藥物的毒副作用使體質(zhì)較差的患者難以耐受，極大地降低了患者的生存質(zhì)量。因此，臨床上尋求一種既能抑制肝癌的生長(zhǎng)，又無明顯的毒副作用、提高患者生存質(zhì)量的藥物迫在眉睫。

惡性腫瘤包括肝癌在內(nèi)，共同生物學(xué)特征是細(xì)胞的失控增長(zhǎng)，即細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖失衡。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為目前腫瘤綜合治療的重要途徑之一[6]。KLT注射液是從傳統(tǒng)中藥薏苡仁中提取的新型雙相廣譜中藥制劑，具有多靶點(diǎn)治療、提高晚期癌癥患者的生存質(zhì)量和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，目前臨床已應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌[7]、胃癌[8]、大腸癌[9]等惡性腫瘤的綜合治療中。本研究通過MTT法觀察，結(jié)果表明，KLT能夠有效抑制肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖，抑制率呈明顯的時(shí)間、濃度依賴性，且10、30、50 ml/L抑制作用明顯。

蘇偉賢等[8]將不同濃度的KLT作用于人SGC-7901胃癌細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，胃癌細(xì)胞核漿比例顯著縮小，細(xì)胞惡性程度降低，細(xì)胞分化趨向良性；本研究細(xì)胞爬片HE染色示，發(fā)現(xiàn)給藥后Hepa1-6肝癌細(xì)胞偽足回縮，細(xì)胞變小、變圓，核分裂相減少，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象，傳代能力減弱，且呈濃度依賴性。進(jìn)一步提示KLT可能在一定程度上能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而出現(xiàn)的一種由多種凋亡相關(guān)基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡功能的抑制將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。因此，以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的重要策略之一[11-12]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)KLT可以誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡，且凋亡峰隨著KLT作用濃度的增高而升高，細(xì)胞增殖受到抑制，提示KLT抗腫瘤作用可能通過其促凋亡機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。

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