何欣蓉，劉 馨，黃一凡，文 彬

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000）

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）家族的一個(gè)亞族，其被多種生長因子和細(xì)胞因子激活后，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等。ERK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它包括ERK1～7及最近發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)形式ERK50[1]。其中 ERK1（P44MAPK）和 ERK2（P42MAPK）是兩個(gè)高度同源的亞型，均是MAPK家族中第一個(gè)被克隆的成員，其同源性接近85%，對其他ERK則了解較少。近年來研究表明，ERK1/2過度活化與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2]。本研究擬通過檢測肺癌和肺良性病變組織中ERK2的表達(dá)，探討ERK2蛋白與肺癌的組織類型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 選取2007～2008年我院肺癌根治術(shù)標(biāo)本77例為實(shí)驗(yàn)組，另選取20例良性肺疾病組織為對照組。全部病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)。其中，男性58例，女性19例；年齡39～73歲，平均64.7歲。組織學(xué)分類：腺癌16例，鱗癌54例，腺鱗癌2例，肉瘤樣癌3例，小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例。高分化10例，中分化14例，低分化46例。轉(zhuǎn)移狀況：有淋巴轉(zhuǎn)移42例，無轉(zhuǎn)移28例。同時(shí)收集肺大皰10例，肺結(jié)核6例，肺膿腫4例，共計(jì)20例作為對照。

1.1.2 試劑 兔抗人ERK2多克隆抗體購自北京中杉金橋公司，使用濃度為1∶100。二抗、即用型二步法檢測試劑盒PV-9000和DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

以ERK2為陽性的乳腺癌組織為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，采用SP法進(jìn)行染色。具體步驟如下：石蠟標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，對切片進(jìn)行預(yù)處理。3%過氧化氫去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗，2 min×3次。滴加一抗，4℃濕盒過夜。PBS沖洗3次，2 min×3次。滴加PV-9000工作液，37℃濕盒內(nèi)孵育30 min，PBS沖洗，2 min×3次。選用DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.3 結(jié)果判斷

DAB顯色法陽性染色為棕黃色顆粒，ERK2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中偶見散在陽性物質(zhì)表達(dá)。參照1996年5月北京《全國免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會》標(biāo)準(zhǔn)[3]，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×400）。計(jì)數(shù)每個(gè)視野中染色陽性細(xì)胞數(shù)。 陽性細(xì)胞＜20%為（-），＞20%為（+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 肺癌中ERK2蛋白的表達(dá)

本組77例肺癌標(biāo)本中，ERK2的陽性率為51.9%，明顯高于良性肺疾病組（20.0%），兩者比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 ERK2蛋白表達(dá)與肺癌主要病理特征的關(guān)系

77例肺癌標(biāo)本中，腺癌16例，鱗癌54例，腺鱗癌2例，小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例，肉瘤樣癌3例。因腺鱗癌、小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肉瘤樣癌例數(shù)過少，沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。腺癌中有10例ERK2陽性（陽性率為62.5%），和鱗癌的ERK2陽性率之間相互比較（鱗癌中有27例陽性，陽性率為50.0%），兩者無顯著性差異（P＞0.05）；組織學(xué)分級：高分化10例（陽性2例，陽性率為 20.0%），中分化 14例（陽性 4例，陽性率為28.6%），低分化46例（陽性31例，陽性率為67.4%），低分化和高、中分化的陽性率之間有顯著性差異（P＜0.05）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例（陽性8例，陽性率為28.6%），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例（陽性29例，陽性率為69.1%），兩者之間ERK2表達(dá)有顯著性差異（P＜0.05）。 見表1。

表1 ERK2蛋白表達(dá)與肺癌主要臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab.1 The relationship between ERK2 protein expression and major clinical pathological features of lung cancer(case)

3 討論

ERK信號通路在細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等方面起著關(guān)鍵作用[4]。目前研究顯示，ERK在肝癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌及前列腺癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)或活性增強(qiáng)[5-8]，Bang等[9]在胃癌組織中檢測到ERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而Price等[10]及Mandell等[11]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和前列腺癌組織中的研究表明，腫瘤組織中ERK蛋白表達(dá)未見明顯增加。在肺癌中，ERK蛋白的表達(dá)結(jié)果目前也不甚一致，ERK1/2在肺癌中表達(dá)升高，與患者的年齡、性別、腫瘤類型無相關(guān)性，ERK1/2的蛋白表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期密切相關(guān)[12]。Greenherg等[13]發(fā)現(xiàn)ERK在肺癌組織中的活性無明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，ERK2在肺癌中蛋白陽性率為51.9%，高于良性病變組織，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。

谷艷嬌等[14]發(fā)現(xiàn)ERK1/2在肺癌組織中按照年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較無顯著性差異（P＞0.05）；按照腫瘤分化程度比較，高分化組表達(dá)較低，中分化組次之，低分化組表達(dá)最高，具有顯著性差異。而Kiyokawa等[15]研究了胃癌組織中ERK mRNA的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，高分化癌高表達(dá)比例高于低分化癌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERK2的蛋白表達(dá)在腺癌和鱗癌中無顯著性差異；和組織學(xué)分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。低分化組的陽性率最高，中分化組次之，高分化組最低；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌陽性率低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

目前已知的ERK通路：細(xì)胞外信號→細(xì)胞受體→細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶和適配蛋白→Ras→Raf→MEKK1→MEK1→ERK1/2→轉(zhuǎn)錄因子→細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)→細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化。由上述的激活途徑來看，ERK通路是一條瀑布似的反應(yīng)鏈，因此其啟動因素對于該通路的激活至關(guān)重要。由此也提出一個(gè)問題：ERK通路激活的原因到底是什么？ERK/MAPK活性增高可能是高水平生長因子刺激一腫瘤來源或內(nèi)源性生長因子自主的、持久的自分泌或旁分泌反饋環(huán)的存在；或者是其上游信號分子突變的結(jié)果。已有一些研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子等能激活該通路，但還有待進(jìn)一步的研究和探討。

總之，ERK1/2異常活化可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的促進(jìn)作用，但ERK1/2的具體作用機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步研究。

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