呂慧 閆惠琴 王岷 李永文 萬海粟 劉紅雨 吳蘅 周清華

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，也是人類腫瘤中最容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤之一。影響肺癌患者預(yù)后和生存的最主要原因是肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。因此，研究和闡明調(diào)控肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。

我們前期的研究[2]從人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株WCQH29801分離構(gòu)建不同轉(zhuǎn)移潛能的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NL9980和L9981。L9981細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的克隆形成能力和侵襲力，在裸鼠體內(nèi)的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移能力為100%，均顯著高于NL9980細(xì)胞[2-5]。因此我們推測(cè)二者之間差異表達(dá)基因可能與L9981的侵襲及克隆能力強(qiáng)有關(guān)。表觀遺傳學(xué)是研究無DNA序列變化、可遺傳的基因表達(dá)（活性）的改變的一門學(xué)科[6]。DNA甲基化是表觀遺傳的主要方式，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基團(tuán)，使之變成5-甲基胞嘧啶（5 mC）的化學(xué)修飾過程，當(dāng)基因啟動(dòng)子高甲基化時(shí)使基因失活，去（低）甲基化則使基因重新開放[7]。因此我們采用甲基化芯片雜交技術(shù)[8,9]對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞株的差異甲基化基因進(jìn)行比較，從而進(jìn)一步探討甲基化在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用。該技術(shù)主要是利用特定抗體對(duì)甲基化的胞嘧啶進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitation）使甲基化和非甲基化的胞嘧啶分離，并對(duì)分離出的甲基化DNA片段進(jìn)行基因芯片雜交，實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)。該方法對(duì)任意序列背景下的甲基化胞嘧啶均能實(shí)現(xiàn)免疫沉淀，分辨率相對(duì)較高，信息量較大，有助于發(fā)現(xiàn)兩者的差異甲基化基因及新基因[10]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 NL9980（低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株）、L9981（高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株）均由天津市肺癌研究所提供。

1.2 常用試劑及設(shè)備 精制小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；使用120 mmol/L的NaOH溶液配成1 mmol/L的貯備液，4oC 貯存；TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（Tiangen,Cat. No. DP304-03）；Resi: MBD2b蛋白-sepharose-4B柱（上海生物芯片公司）；QIAquick PCR purification kit（Qiagen, Cat. No. 28106）；Cy3、Cy5 9mer Wobble（50,200 O.D.）（TriLink Bio-technologies, Cat. No. N46-0010）Linker（15P）oligo JW102（40 μM）；oligo JW103（40 μM）；CPK6 48mer oligos（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）；NimbleGen Hybridization Kit 40 Refill（Nimblegen, Cat. No. KIT005-2）；雜交爐（HB-1000 HYBRIDIZER）美國(guó)UVP LAB-ORATORY公司；掃描儀（AXON INSTRUMENTS GENE PIX 4000B）美國(guó)AXON公司；NimbleScanTM2.2：購(gòu)自NimbleGen公司。

1.3 基因芯片 項(xiàng)目所用芯片SBC human CHIP：定制于上海生物芯片有限公司。探針為Nimblegen設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)原則是：一段DNA序列＞250 bp，GC含量＞57%時(shí)，認(rèn)為這一段為CpG島。探針一共有3 678 702條，每個(gè)島所含的探針個(gè)數(shù)，從10多到30多不等，大小均為50 nt在芯片中平均分布。

1.4 提取L9981、NL9980細(xì)胞株的基因組DNA 用TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA，詳細(xì)操作方法和原理見TIANamp Genomic DNA Kit protocol。并用分光光度計(jì)定量及普通凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.5 對(duì)L9981、NL9980細(xì)胞株的基因組DNA進(jìn)行超聲破碎用超聲破碎儀將L9981、NL9980細(xì)胞的基因組DNA破碎成DNA片段。并用分光光度計(jì)定量及普通凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.6 甲基化免疫沉淀方法富集甲基化DNA 通過Resi:MBD2b蛋白-sepharose-4B柱富集甲基化片斷。然后用連接介導(dǎo)PCR（ligation-mediated PCR, LM-PCR）的方法[11]進(jìn)行2次擴(kuò)增。并用分光光度計(jì)定量及普通凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.7 芯片雜交及分析 應(yīng)用寡核苷酸直接摻入法分別將Cy3和Cy5標(biāo)記擴(kuò)增的L9981及NL9980細(xì)胞株的DNA片段，然后NimbleGen Array Hybridization Kit與高通量甲基化芯片進(jìn)行雜交產(chǎn)生2張芯片。使用NimbleScanTM2.2（NimbleGen）分析結(jié)果。用SignalMapTM對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將2張芯片的數(shù)據(jù)調(diào)至同一個(gè)水平。

1.8 生物信息學(xué)分析 用GenBank注釋基因，并將甲基化差異基因分別上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http://david.abcc. ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行基因類型（GENE ONTOLOGY, GO）分類，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)通路的分類，以及MILANO網(wǎng)站（http://milano.md.huji.ac.il）進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。

2 結(jié)果

2.1 L9981、NL9980細(xì)胞株的基因組DNA 兩組細(xì)胞抽取提純后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，基因組DNA條帶清晰完整，長(zhǎng)度約20 kDa，無降解，無蛋白質(zhì)雜帶（圖1）。分光光度計(jì)結(jié)果顯示L9981及NL9980 DNA的OD260/OD280的比值均在1.7-2.0之間，提示所提的DNA純度高。

2.2 超聲破碎后的L9981、NL9980細(xì)胞株的基因組DNA片段 對(duì)基因組DNA進(jìn)行超聲破碎后行凝膠電泳檢測(cè)，L9981及NL9980 DNA電泳條帶呈彌散狀，片段長(zhǎng)度在500 bp-1 300 bp之間（圖2），當(dāng)DNA片段長(zhǎng)度在300 bp-1 300 bp之間時(shí)便于與Resi:MBD2b蛋白-sepharose-4B柱結(jié)合。

2.3 甲基化DNA 在普通凝膠電泳結(jié)果示L9981及NL9980 DNA電泳條帶呈彌散條帶，與基因破碎后的彌散條帶大致相同，在300 bp-1 000 bp之間，在500 bp附近亮度最高（圖3）。

2.4 芯片雜交及分析結(jié)果 圖4所示芯片完整，無高信號(hào)和低信號(hào)的團(tuán)塊和劃痕，芯片的中央、四個(gè)角及中線與四個(gè)邊交點(diǎn)處的紅色十字架及平均分布的紅點(diǎn)顯示完全且清楚，說明芯片的雜交、洗滌、掃描步驟質(zhì)量良好。Cy3通常顯示綠色，Cy5顯示紅色，當(dāng)某位點(diǎn)在芯片上呈綠色，則表示Cy3信號(hào)強(qiáng)，提示該位點(diǎn)在L9981中表現(xiàn)為高甲基化；反之，當(dāng)位點(diǎn)呈紅色，則表示Cy5信號(hào)強(qiáng)，提示該位點(diǎn)在L9981中表現(xiàn)為低甲基化；而位點(diǎn)呈黃色則表示該位點(diǎn)在兩個(gè)細(xì)胞株內(nèi)無甲基化差異。由圖4可見芯片整體呈黃色，意味著大部分的位點(diǎn)無差別，符合小部分位點(diǎn)甲基化程度變化的假設(shè)。

表 1 L9981中高甲基化和低甲基化基因數(shù)目Tab 1 The number of hypermethylated and hypomethylated genes in L9981

表 2 甲基化差異基因分類Tab 2 The gene ontology of the hypermethylated and hypomethylated genes in L9981

圖5所示為標(biāo)準(zhǔn)化前后的M-A圖，豎坐標(biāo)0水平以上為上調(diào)基因，0水平以下為下調(diào)基因。根據(jù)文獻(xiàn)[12]，我們?nèi)y3/Cy5＞2，即豎坐標(biāo)log2（Cy3/Cy5）＞1表示在L9981中高甲基化的基因；Cy3/Cy5＜0.5，即豎坐標(biāo)log2（Cy3/Cy5）＜-1表示在L9981中低甲基化的基因；而當(dāng)Cy3/Cy5在0.5-2或log2（Cy3/Cy5）在-1-1之間時(shí)，表明該基因在L9981及NL9980中無甲基化差異。通過分析，芯片中共顯示29 369個(gè)甲基化位點(diǎn)，其中19 369個(gè)為已知基因CpG島。其中大部分基因的Cy3/Cy5比值在0.5-2之間，我們認(rèn)為這些基因在L9981和NL9980之間無甲基化差異，這與芯片掃描圖及M-A plot的結(jié)果一致。這些無甲基化差異的基因包括nm23-H1基因。只有少量的基因出現(xiàn)了甲基化的差異（表1）。在L9981細(xì)胞株中有1 552個(gè)高甲基化DNA片斷，涉及735個(gè)基因，其中包括656個(gè)已知基因及79個(gè)未知基因。低甲基化DNA片段1 787個(gè)，涉及809個(gè)基因，其中698個(gè)已知基因片段及111個(gè)未知基因。

2.5 基因篩選結(jié)果 在這些差異基因中無nm23，表示nm23基因在這兩個(gè)細(xì)胞株中無甲基化狀態(tài)差異。通過GO分類我們發(fā)現(xiàn)：這些差異甲基化基因主要集中在細(xì)胞生物進(jìn)程及其調(diào)節(jié)、代謝及其調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附及血管生成等相關(guān)的基因，其中基因分類及基因數(shù)目的部分結(jié)果見表2。通過MILANO對(duì)這些差異基因進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，選出我們感興趣的基因。高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株L9981抑癌基因CDKN2A（p16）、RUNX3、HOXA5、PPP2CA、APC2等呈高甲基化，而癌基因Bcl-2、BMI1呈低甲基化。

圖 1 L9981和NL9980細(xì)胞株基因組DNA凝膠電泳圖Fig 1 Gel electrophoresis of genome DNA of L9981 and NL9980

圖 2 L9981和NL9980細(xì)胞基因組DNA超聲破碎后凝膠電泳圖Fig 2 Gel electrophoresis of DNA frangments of L9981 and NL9980 by sonication

圖 3 甲基化DNA的PCR擴(kuò)增Fig 3 PCR amplification of methylated DNA

圖 4 芯片圖片。A：芯片掃描的全景圖；B：質(zhì)控部分的放大圖，可以清晰看到中央十字及四角紅點(diǎn)。Fig 4 The picture of chip. A: The scanning picture of chip; B: The enlarged picture of quality parts, in which red cross in center and red pots in corner are clear.

圖 5 標(biāo)準(zhǔn)化前后的M-A圖Fig 5 The M-A plot before and after the normalization

表2所示，大部分甲基化差異基因參與了信號(hào)通路的傳導(dǎo)，經(jīng)KEGG進(jìn)行信號(hào)途徑的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)途徑主要包括：細(xì)胞粘附因子、MAPK信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。細(xì)胞粘附因子在L9981中主要呈低甲基化，而涉及MAPK、WNT、Notch、Hedgehog通路的基因在L9981中主要呈現(xiàn)高甲基化（表3）。

3 討論

異常甲基化是腫瘤的發(fā)生發(fā)展的重要原因，主要表現(xiàn)在抑癌基因的高甲基化及全基因組、癌基因的低甲基化[13,14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在L9981細(xì)胞株中有1 552個(gè)高甲基化DNA片斷，涉及735個(gè)基因，其中包括656個(gè)已知基因及79個(gè)未知基因。低甲基化DNA片段1 787個(gè)，涉及809個(gè)基因，其中698個(gè)已知基因片段及111個(gè)未知基因。通過DAVID對(duì)這些已知基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們主要涉及細(xì)胞生物進(jìn)程及其調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附及血管生成等，與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。其中抑癌基因CDKN2A（p16）、RUNX3、HOXA5、PPP2CA、APC2在L9981中為高甲基化，提示他們可能在L9981中表達(dá)缺失或下降。而癌基因Bcl-2、BMI1則在L9981中呈低甲基化，提示他們可能在L9981中過表達(dá)。因此我們推測(cè)，抑癌基因的高甲基化及癌基因的低甲基化可能是L9981具有更強(qiáng)侵襲及克隆能力的原因。并推測(cè)，在L9981中呈高甲基化的基因功能未明或未知基因可能為潛在的腫瘤抑制基因或腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，但尚需進(jìn)一步證實(shí)。

表 3 高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中甲基化差異基因參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路Tab 3 The signal transduction of the hypermethylated and hypomethylated genes in L9981 lung cancer cell line

信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。通過GO分類我們發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞間大部分的差異甲基化基因參與了信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中與信號(hào)通路有關(guān)的高甲基化的基因?yàn)?53個(gè)，低甲基化的基因?yàn)?72個(gè)。將這些基因上傳至KEGG進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這些基因涉及細(xì)胞粘附因子、MAPK信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、p53信號(hào)通路。在L9981中，大部分通路的負(fù)向調(diào)節(jié)基因呈現(xiàn)高甲基化，而正向調(diào)節(jié)基因呈低甲基化。其中WNT通路中負(fù)向調(diào)節(jié)基因SFRP2、SFRP4、SOX17及RUNX3、APC2、PPP2CA等在高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株L9981中表現(xiàn)為高甲基化，而正向調(diào)節(jié)基因LRP5、TBL1X則為低甲基化。通過GO分類及MILANO文獻(xiàn)檢索，我們發(fā)現(xiàn)在L9981中MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、p53信號(hào)通路均存在負(fù)向調(diào)節(jié)基因的高甲基化及正向調(diào)節(jié)基因的低甲基化，而Hedgehog及Notch信號(hào)通路主要表現(xiàn)為負(fù)向調(diào)節(jié)基因的高甲基化。同時(shí)值得一提的是，參與細(xì)胞粘附分子通路的基因則以低甲基化為主，其中CDH2、ICOSLG、MAG、MPZL1、NLGN1、NRCAM、NRXN2、SDC2在L9981細(xì)胞株中表現(xiàn)為低甲基化，而CDH4、CNTNAP2表現(xiàn)為高甲基化，這些基因參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions, EMT）過程[16,17]。而后者為腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。甲基化在EMT中扮演的作用尚需進(jìn)一步研究。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟共同作用的結(jié)果，DNA甲基化是其中一個(gè)因素。運(yùn)用高通量的基因芯片，我們發(fā)現(xiàn)在不同轉(zhuǎn)移潛能的人大細(xì)胞肺癌株中甲基化差異基因涉及細(xì)胞生物進(jìn)程及其調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附及血管生成等。同時(shí)我們注意到在L9981中信號(hào)通路負(fù)向調(diào)節(jié)基因的高甲基化及正向調(diào)節(jié)基因的低甲基化可能促使信號(hào)傳導(dǎo)通路的開放而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。由于芯片信息量大且受方法學(xué)限制，我們尚需對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘及驗(yàn)證。