馮凌，羅義

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071

底泥水體中適用于PCR的不同形態(tài)DNA的提取方法

馮凌，羅義*

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071

提出直接從環(huán)境河流底泥和表層水體中同時(shí)提取不同形態(tài)DNA（胞內(nèi)、胞外、染色體和質(zhì)粒DNA）的有效方法.利用該方法提取了海河典型區(qū)域底泥的胞外DNA和胞內(nèi)DNA及水體中細(xì)菌染色體DNA和質(zhì)粒DNA.結(jié)果表明，NaH2PO4提取的胞外DNA分子量大于1kb，提取率40%～72%，沒有共提取胞內(nèi)DNA.胞內(nèi)DNA提取的分子量均大于23.1kb，細(xì)菌質(zhì)粒DNA與染色體DNA同時(shí)分離.16S rDNA與sul2擴(kuò)增驗(yàn)證提取方法可靠性.16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果顯示所有胞外DNA呈陰性，胞內(nèi)DNA呈陽性.質(zhì)粒DNA和染色體DNA的16S rDNA擴(kuò)增顯示，染色體DNA結(jié)果顯陽性，質(zhì)粒DNA呈陰性，sul2的結(jié)果相反.

胞外DNA；胞內(nèi)DNA；染色體DNA；質(zhì)粒DNA；提取方法

Received 13 December 2009 accepted 10 January 2010

Abstract：In this paper,effective methods were presented to extract different gene types（extracellular DNA,intracellular DNA,genome DNA and plasmid DNA）from the sediments and water in environment.The methods were used for extracted extracellular DNA and intracellular DNA in sediments while genome DNA and plasmid DNA of bacteria in water in typical regions of Haihe River.Results showed that extracellular DNA was more than 1kb in size;its recovery ratio was 46%～72%without containing intracellular DNA by using NaH2PO4.All intracellular DNA were more than 23.1kb in size.Genome DNA and plasmid DNA were separated simultaneously.PCR amplification of 16S rDNA and sul2 were applied for assurance of the methods.Results showed that products of 16S rDNA of all the extracellular were negative while intracellular DNA positive.The genome DNA amplified of 16S rDNA turned out to be positive while of sul2 was negative,the results of plasmid DNA were the opposite.

Keywords：extracellular DNA；intracellular DNA；genome DNA；plasmid DNA；extraction

1 引言（Introduction）

近年來，抗生素的濫用導(dǎo)致在動(dòng)物腸道細(xì)菌誘導(dǎo)產(chǎn)生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes, ARGs），抗性基因從動(dòng)物腸道細(xì)菌向環(huán)境土著細(xì)菌傳播擴(kuò)散，使其成為一類新型環(huán)境污染物，其在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播擴(kuò)散目前已引起廣泛關(guān)注（Knapp et al.,2008;Krumperman,1983;Nielsen et al.,1998;2007;Pei et al.,2006;Pruden et al., 2006;羅義等，2008;高盼盼等，2009）.現(xiàn)代分子生物學(xué)PCR技術(shù)已被越來越多地用于環(huán)境樣本中抗性基因的檢測，如何獲得高質(zhì)量的DNA模板是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前提.目前采用的環(huán)境樣本DNA的提取方法大都建立在對(duì)細(xì)胞內(nèi) DNA的提取上（Volossiouk et al.,1995;Clesceri et al.,1995）.然而，無論在陸地生態(tài)系統(tǒng)還是水生態(tài)系統(tǒng)都已檢測到胞外游離DNA的存在（Zhu,2006;Gallori et al.,1994;Poté et al.,2003）.許多研究表明，環(huán)境中包含持久性存在的游離態(tài)DNA.這些胞外DNA可以吸附在底泥和土壤的復(fù)雜顆粒物上，減少與脫氧核糖核酸酶接觸而避免降解（Niemeyer and Gessler,2002）.Romanowski等（1991）在土壤中加入質(zhì)粒DNA，在60d后仍能檢測到其存在.研究表明，細(xì)胞外游離態(tài)的DNA分子同樣可以作為抗性基因的攜帶者，可通過與環(huán)境中的細(xì)菌接觸發(fā)生基因水平擴(kuò)散從而將抗性基因整合或轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入其它微生物體內(nèi)（Paget and Simonet,1994），使得這些菌體獲得抗性.因此，在抗生素抗性基因的研究中需要重視對(duì)環(huán)境中胞外游離態(tài)DNA的研究.

本文旨在建立一種可靠的河流底泥中胞外DNA的提取方法，并與胞內(nèi)DNA提取方法相結(jié)合，同時(shí)分別提取河流水體中細(xì)菌體內(nèi)的染色體DNA和質(zhì)粒DNA.并將此方法應(yīng)用于海河底泥和表層水體不同形態(tài)DNA的提取，為進(jìn)一步研究海河水體中抗性基因的主要存在形態(tài)提供可行性.

2 材料與方法（Material and methods）

2.1 采樣點(diǎn)選取

海河是中國北方重要水系，全長73公里，從西向東流經(jīng)整個(gè)天津.本研究選取海河支干流5個(gè)代表性采樣點(diǎn)：1）大沽橋：干流，位于天津的幾何中心的商業(yè)娛樂區(qū)；2）洪泥河：支流，處于農(nóng)業(yè)區(qū)；3）新開河：支流，城市泄洪與排澇；4）馬廠減河：農(nóng)業(yè)灌溉與城市排澇；5）入?？冢汉：拥慕K點(diǎn)，流入渤海.采集的樣品對(duì)分析對(duì)比不同樣點(diǎn)的DNA形態(tài)有較好的代表性.

具體采樣布點(diǎn)見圖1.

圖1 海河采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of the Haihe River

2.2 樣品采集

采樣在2008年12月進(jìn)行.采集海河表層底泥（0～20cm），水樣在底泥的垂直高度上采集，采集表層水樣（0.5m），記錄水溫.采集的底泥樣品轉(zhuǎn)移到無菌塑料袋中，水樣收集到無菌塑料瓶中，4℃條件下立即運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，24h內(nèi)分析.

2.3 底泥胞外DNA和胞內(nèi)DNA提取

2.3.1 胞外DNA提取

1g底泥，放入10mL滅菌塑料試管，分別加入4mL NaH2PO4（0.12mol·L-1,pH 8.0） 和 100μL sodium dodecyl sulphate（SDS,10%）混勻，250r·min-125℃振蕩10min；添加0.2g polyethylene poly pyrrolidone（PVPP） 混勻，4℃、6000r·min-1離心10min，0.22μm滅菌膜（Osmonics,USA）過濾，上清液收集到另一個(gè)試管A中至于冰上.離心后的沉淀再加4mL NaH2PO4，250r·min-125℃振蕩5min，離心（條件同上）再收集上清液到A中；同上再提取1次.提取得到的上清液放置冰上，下一步提純（Corinaldesi et al.,2005;Ogram et al.,1987）.

2.3.2 胞內(nèi)DNA提取

上述離心后的沉淀和過濾后膜的截留物用于提取胞內(nèi)DNA，采用SDS高鹽法，并做適當(dāng)修改.沉淀和剪碎的濾膜加入 4mL DNA提取液（100mmol·L-1Tris-HCl,100mmol·L-1Na2-EDTA, 100mmol·L-1Na3PO4,1.5mol·L-1NaCl,1%CTAB, 50mg·mL-1protein K）和 0.5g 1mm玻璃珠（酸洗），2500r·min-1振蕩10min；加入1mL SDS（10%）混勻，液氮放置1min后立即60℃水浴20min，重復(fù)3次，4℃、8000r·min-1離心20min，上清液轉(zhuǎn)移到試管B中冰上放置.沉淀再次加入2mL DNA提取液，2500r·min-1振蕩 5min，37℃水浴 2h，加入1mL SDS,60℃水浴20min，4℃、8000r·min-1離心20min.收集上清液到試管B，放置冰上，下一步提純.

2.3.3 胞外DNA提取率

1g底泥樣品在馬弗爐450℃下烘烤2h，加入15μg的E.coli BH5α DNA，用上述的胞外DNA提取方法提取.

2.3.4 方法質(zhì)量控制

驗(yàn)證胞外 DNA提取方法是否共提取胞內(nèi)DNA.將過夜培養(yǎng)的 2mL菌液（E.coli BH5α，OD600=0.35）離心，加入DNase I（10mg·mL-1）37℃溫浴15min（去除胞外DNA影響），過0.22μm滅菌膜，NaCl（1.5mol·L-1）溶液去除DNase殘留.過濾后的膜與經(jīng)過預(yù)處理的底泥樣品（馬弗爐450℃，2h）混合.用上述胞外DNA提取方法提取.提取物經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增.

2.4 水體細(xì)菌中質(zhì)粒DNA和染色體DNA提取

2.4.1 水體中菌體收集

1L水樣過0.22μm滅菌膜（Osmonics,USA），100mL溶液（0.25mol·L-1KH2PO4,0.75mol·L-1MgCl2）（Clesceri et al.,1995）沖洗兩次.膜剪切成碎片放進(jìn) 15mL離心管，加入 1.8mL SET溶液（20% sucrose,50mmol·L-1Tris-HCl,pH 7.6）（Rivera et al.,2003;Sommerville et al.,1989）.

2.4.2 水體中菌體總DNA提取

6000r·min-1離心10min，棄去上清液；250μL溶液Ⅰ（50mmol·L-1sucrose,25mmol·L-1Tris-HCl,10mmol·L-1EDTA,RNase 1mg·mL-1,pH 8.0）重懸菌體，混勻；加入250μL溶液Ⅱ（0.2mol·L-1NaOH和1%SDS）混勻，至于冰上2min；加入250μL KAc（5mol·L-1,pH 4.8），加入的動(dòng)作要快且柔和.混合液置于冰上5min，4℃、12000r·min-1離心10min.

2.4.3 質(zhì)粒DNA和染色體DNA分離

上清液含有質(zhì)粒DNA，沉淀中含有染色體DNA.將上清液轉(zhuǎn)移到另外的試管中.沉淀加入2mL NaCl溶液（1.5mol·L-1），重懸沉淀.

2.4.4 方法質(zhì)量控制

同樣方法提取過夜培養(yǎng)的2mL菌液（E.coli BH5α，OD600=0.35）質(zhì)粒DNA和染色體DNA，作為方法質(zhì)量控制.提取物經(jīng)16S rDNA和sul2 PCR擴(kuò)增.

2.5 純化

提取DNA使用 DNA純化試劑盒（3S Spin Agarose Gel DNA Purifiction Kit Shenergy Biocolor, China）純化.所有的提取物保存在-20℃.

2.6 16S rDNA和sul2擴(kuò)增

16S rDNA擴(kuò)增應(yīng)用于胞外DNA提取質(zhì)量控制（檢驗(yàn)是否共提取了胞內(nèi)DNA），采樣點(diǎn)底泥胞外DNA和胞內(nèi)DNA（提取方法應(yīng)用性），水體染色體DNA和質(zhì)粒DNA（提取方法的應(yīng)用性和分離驗(yàn)證）及E.coli BH5α（分離驗(yàn)證）PCR擴(kuò)增.sul2擴(kuò)增應(yīng)用在E.coli BH5α（分離驗(yàn)證）水體染色體DNA和質(zhì)粒DNA（分離驗(yàn)證）.

表1 DNA擴(kuò)增引物Table 1 Primers of amplification

PCR擴(kuò)增引物見表1.使用 Biometra PCR（Biometra TGradient,Germany）擴(kuò)增儀.反應(yīng)體系溶液包含：12.5μL 2×Taq PCR預(yù)混液［（0.1U·μL-1Taq polymerase,0.5mmol·L-1dNTP（dATP,dCTP, dGTP,dTTP）,3mmol·L-1MgCl2,100mmol·L-1KCl,20mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.3）］和其他的穩(wěn)定劑（Tiangen biotech Ltd.,Beijing,China），0.5μL引物（1μmol·L-1），1μg DNA模板，加dd H2O到最終體積25μL.PCR反應(yīng)條件：（1）16 S rDNA：95℃預(yù)熱 5min，95℃、15s 30個(gè)循環(huán)，56℃退火 30s，72℃延長1min，最后72℃ 5min；陽性對(duì)照大腸桿菌提取的基因組DNA代替模板；（2）sul2：95℃預(yù)熱 5min，95℃、15s 30個(gè)循環(huán)，60.8℃退火 30s，72℃延長1min，最后72℃、5min，陽性對(duì)照是E. coli BH5α提取的質(zhì)粒代替模板.陰性對(duì)照是將模板由無菌水代替，其余不變.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 DNA的純度與濃度表征

使用紫外分光光度法測定 DNA溶液在230nm、260nm、280nm的光度值.DNA純度依據(jù)OD260/280和OD260/230比值，比值越大說明DNA樣品中蛋白質(zhì)和腐殖酸雜質(zhì)的含量越低，DNA樣品越純，反之亦然（Steffen et al.,1988）.實(shí)驗(yàn)提取的DNA溶液OD260/280皆在1.8左右，OD260/230在2.0左右，表明提取物DNA純度較好，不含PCR反應(yīng)的抑制劑，達(dá)到PCR擴(kuò)增要求.

底泥DNA濃度：OD260×50μg·mL-1×稀釋倍數(shù)× DNA溶液體積（mL）/底泥重量（g）；水體DNA濃度：OD260×50μg·mL-1×稀釋倍數(shù)×DNA溶液體積（mL）/水體體積（L）.

電泳：PCR產(chǎn)物（5μL）1.2%凝膠，DNA提取物（5μL）0.7%凝膠電泳，λDNA/HindⅢ與Marker 1作為分子標(biāo)準(zhǔn).凝膠經(jīng)EB染色，凝膠成像系統(tǒng)分析.

3.2 DNA提取方法質(zhì)量控制

底泥中胞外DNA的提取應(yīng)滿足：1.溶液能最大限度的溶解底泥中的DNA；2.不能提取出胞內(nèi)DNA；3.提取DNA的純度要達(dá)到后即的分子實(shí)驗(yàn)要求.很多其他的因素，比如DNA吸附在土壤底泥顆粒物上，共提取的酶抑制劑和DNA的降解或剪切都可能影響DNA的提取效率（Corinaldesi et al.,2005）.針對(duì)胞內(nèi)DNA的提取方法的評(píng)判是：1.分子量大且完整（＞23kb）；2.沒有分子分析抑制物（OD260/280），必須適用于樣品分析和后繼的DNA擴(kuò)增.

方法質(zhì)量控制結(jié)果，胞外DNA經(jīng)16S rDNA電泳未出現(xiàn)條帶，提取溶液中未含有胞內(nèi)DNA，說明建立的胞外 DNA提取方法可靠.底泥提取DNA經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增后，所有的胞外DNA擴(kuò)增產(chǎn)物呈陰性，胞內(nèi)DNA呈陽性（圖2）.提取物不經(jīng)稀釋即可使用.試驗(yàn)數(shù)據(jù)和PCR結(jié)果表明上述的提取方法適用于不同區(qū)域底泥的胞外胞內(nèi)DNA提取，而且可以用于后繼的分子分析，方法簡易可行.

在堿性條件下大分子的線性染色體DNA彼此聯(lián)結(jié)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜、蛋白等形成共沉淀，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA仍然懸浮在上清液中，通過離心分離質(zhì)粒DNA與染色體DNA.

驗(yàn)證同時(shí)提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA的方法.在方法質(zhì)量控制中，利用建立的方法提取已知標(biāo)準(zhǔn)菌（構(gòu)建含有 sul2抗性基因質(zhì)粒的 E.coli BH5α）染色體DNA和質(zhì)粒DNA.質(zhì)粒DNA包括環(huán)狀質(zhì)粒DNA和開環(huán)線狀質(zhì)粒DNA.本實(shí)驗(yàn)提取的環(huán)狀質(zhì)粒DNA多于開環(huán)質(zhì)粒DNA，根據(jù)圖中泳帶亮度可得，提取比例大約是3：1到4：1（圖3）.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NaOH是實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞膜裂解的關(guān)鍵. Frerix等（2007）表明NaOH濃度影響質(zhì)粒DNA和染色體DNA的獲得量.時(shí)間和動(dòng)作劇烈程度對(duì)提取很重要，一旦染色體DNA在裂解中斷裂，不會(huì)在中和條件下沉淀.經(jīng)16S rDNA和sul2 PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，染色體DNA的16S rDNA結(jié)果全部陽性而sul2呈陰性，證明提取的染色體DNA沒有包含質(zhì)粒DNA；質(zhì)粒DNA的16S rDNA結(jié)果呈陰性而sul2的 PCR結(jié)果呈陽性，證明沒有參雜染色體DNA.

采樣點(diǎn)水體中菌體提取的質(zhì)粒DNA和染色體DNA全部進(jìn)行16S rDNA和sul2的PCR擴(kuò)增.染色體DNA的16S rDNA結(jié)果全部陽性而sul2呈陰性，證明提取的染色體DNA沒有包含質(zhì)粒DNA；質(zhì)粒DNA的16S rDNA結(jié)果呈陰性而sul2的PCR結(jié)果呈陽性，證明沒有參雜染色體DNA（圖4）.該方法表明同時(shí)提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA的方法可以應(yīng)用在環(huán)境樣品的提取過程，而且在分子分析中可以直接使用.

3.3 海河底泥中胞外DNA和胞內(nèi)DNA濃度

胞外DNA提取率的分光值表明不同的底泥樣品的提取率為40%～72%，與Corinaldesi等（2005）從海洋底泥中提取胞外DNA的提取率34%～60%接近，Corinaldesi等（2005）同時(shí)發(fā)現(xiàn)胞外 DNA的含量是胞內(nèi)DNA的10～70倍.本研究結(jié)果表明，海河底泥5個(gè)采樣點(diǎn)都存在相當(dāng)濃度的游離態(tài)胞外DNA，其濃度明顯高于胞內(nèi)DNA（圖5）.不同區(qū)域的胞外DNA含量不同，大沽橋>馬廠減河、洪泥河>新開河、海河入?？?本研究對(duì)5個(gè)樣點(diǎn)底泥的統(tǒng)計(jì)分析表明（SPSS），海河底泥胞外DNA濃度與底泥中的黏粒含量有很好的相關(guān)性（r=0.979, p=0.01），這與底泥黏粒對(duì)DNA的吸附提供保護(hù)、減少核酸酶降解密切相關(guān).電泳圖分子量大小表明提取的胞外DNA大于1kb（圖6）.5個(gè)采樣點(diǎn)底泥中胞內(nèi)DNA含量不同，馬廠減河、洪泥河>大沽橋>新開河>海河入?？冢▓D5），提取物均大于23.1kb，提取過程無明顯降解和剪切現(xiàn)象（圖6）.本研究表明底泥中存在的胞外DNA形態(tài)占很重要的比例，在研究中這部分形態(tài)的DNA不能忽視.

3.4 海河水體中染色體DNA和質(zhì)粒DNA濃度

從5個(gè)采樣點(diǎn)水體中菌體的染色體DNA和質(zhì)粒DNA結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大部分都以染色體DNA形態(tài)存在（圖7）.提取的水體菌體染色體DNA含量和質(zhì)粒DNA含量均以洪泥河樣品最高，其他各區(qū)域差異不大.

圖7 海河水體中提取DNA濃度Fig.7 The concentration of DNA extraction in water of Haihe River

不同形態(tài)DNA提取的細(xì)化在研究中是非常必要的.Potè等（2003）和Agnelli等（2004）發(fā)現(xiàn)胞外DNA遷移性很強(qiáng)，可從土壤的上層遷移到底層.如果這些胞外DNA攜帶有致病基因并遷移到地下水中，將對(duì)人類健康造成最直接的威脅.如果攜帶抗性基因的胞外DNA轉(zhuǎn)移到土著微生物體內(nèi)，將直接影響環(huán)境中微生物群落的進(jìn)化及生物種群多樣性（Lorenz and Wackernagel,1994）.同時(shí)質(zhì)粒DNA與染色體DNA的分離，對(duì)定位環(huán)境中功能基因的研究，闡述基因分布、傳播有很大的幫助.

本研究提出了從環(huán)境樣本同時(shí)提取不同形態(tài)DNA的方法，是進(jìn)一步細(xì)化分子生物研究有效的DNA提取方法，該方法對(duì)于進(jìn)一步研究抗生素抗性基因在環(huán)境中的主要存在形態(tài)提供了有效的方法學(xué)支持.

Agnelli A,Ascher J,Corti G,Ceccherini M T,Nannipieri P, Pietramellara G.2004.Distribution of microbial communities in a forest soil profile investigated by microbial biomass, soil respiration and DGGE of total and extracellular DNA［J］.Soil Biology Biochemistry,36（5）：859-868

ClesceriL S,Eaton A D,Greenberg A.E.1995,Standard MethodsfortheExaminationofWaterandWastewater［M］. Washington DC:American Public Health Association

Corinaldesi C,Danovaro R,Dell’Anno A.2005.Simultaneous recovery of extracellular and intracellular DNA suitable for molecularstudies from marine sediments［J］.Applied and Environmental Microbiology,71（1）：46-50

Frerix A,Geilenkirchen P,Müller M,Kula M R,Hubbuch J. 2007.Separation ofgenomicDNA,RNA and open circular plasmid DNA from supercoiled plasmid DNA by combining denaturation,selective renaturation and aqueous two-phase extraction［J］.Biotechnology and Bioengineering,96（1）：57-66

Gallori E,Bazzicalupo M,Dal Canto L,Fani R,Nannipieri P, Vettori C,Stotzky G.1994.Transformation of Bacillus subtilis by DNA bound on clay in non-sterilesoil［J］.FEMS Microbiology Ecology,15（1-2）：119-126

Gao P P,Luo Y,Zhou Q X,Mao D Q.2009.Research advancement of antibiotic resistance genes（ARGs）in aquaculture environment［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,4（6）：770-779（in Chinese）

Knapp C W,Engemann C A,Hanson M L,Keen P L,Hall K. J,Graham D W.2008.Indirect evidence of transposon-mediated selection of antibiotic resistance genes in aquatic systems at low leveloxytetracycline exposures［J］.EnvironmentalScience & Technology,42（14）：5348-5353

西部作為欠發(fā)達(dá)地區(qū)，經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展水平整體落后于中東部地區(qū)，醫(yī)療技術(shù)水平也不例外。遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（以下簡稱“遵醫(yī)附院”）院長余昌胤認(rèn)為，制約西部地區(qū)醫(yī)療技術(shù)發(fā)展主要有以下四方面原因。

Krumperman P H.1983.Multiple antibiotic resistance indexing of Escherichia coli to identify high-risk sources of fecal contamination of foods［J］.Applied and Environmental Microbiology,46（1）：165-170

Lorenz M G,Wackernagel W.1994.Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews,58（3）：563-602

Luo Y,Zhou Q X.2008.Antibiotic resistance genes（ARGs）as emerging pollutants［J］.Acta Scientiae Circumstantiae,28（8）：1499-1505（in Chinese）

Nielsen K M,Bones A M,Smalla K,Van Elsas J D.1998. Horizontalgene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteri-a rare event？［J］.FEMS Microbiology Reviews,22（2）：79-103

Nielsen K M,Johnsen P J,Bensasson D,Daffonchio D.2007. Release and persistence of extracellular DNA in the environment［J］.Environmental Biosafety Research,6（1-2）：37-53

Niemeyer J,Gessler F.2002.Determination of free DNA in soils［J］.Journal of Plant Nutrition and Soil Science,165（2）：121-124 Ogram A,Sayler G S,Barkay T.1987.The extraction and purification of microbial DNA from sediments［J］.Journal of Microbiological Methods,7（2-3）：57-66

Paget E,Simonet P.1994.On the track of natural transformation in soil［J］.FEMS Microbiology Ecology,15（1-2）：109-118

Pei R,Kim S C,Carlson K H,Pruden A.2006.Effect of river landscape on the sediment concentrations of antibiotics and corresponding antibiotic resistance genes（ARG）［J］.Water Research, 40（12）：2427-2435

Pruden A,Pei R,Storteboom H,Carlson K H.2006.Antibiotic resistance genes as emerging contaminants:Studies in Northern Colorado［J］.Environmental Science& Technology,40（23）：7445-7450

Rivera I N,Lipp E K,Gil A,Choopun N,Huq A,Colwell R R.2003.Method of DNA extraction and application of multiplex polymerse chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 from aquatic ecosystem［J］.Environmental Microbiology, 5（7）：599-606

Romanowski G,Lorenz M G,Wackernagel W.1991.Adsorption ofplasmid DNA to mineralsurfaces and protection against DNaseI［J］.Applied and Environmental Microbiology,57（4）：1057-1061

Sommerville C C,Knight I T,Straube W L,Carlson K H. 1989.Simple,rapid method for direct isolation of nucleic acids from aquatic environments［J］.Applied and Environmental Microbiology,55（3）：548-554

Steffan R J,Coks?yr J,Bej A K,Atlas R M.1988.Recovery of DNA from soils and sediments［J］.Applied and Environmental Microbiology,54（12）：2908-2915

Volossiouk T,Robb E J,Nazar R N.1995.Direct DNA extraction

for PCR-mediated assays of soil organisms［J］.Applied and Environmental Microbiology,61（11）：3972-3976

Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,LaneD J.1991.16S Ribosomal DNA amplification forphylogeneticstudy［J］. Journal of Bacteriology,173（2）：697-703

Zhu B.2006.Degradation of plasmid and plant DNA in water microcosms monitored by natural transformation and real-time polymerase chain reaction（PCR）［J］.Water Research,40（17）：3231-3238

中文參考文獻(xiàn)

高盼盼,羅義,周啟星,毛大慶.2009.水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因（ARGs）的研究及進(jìn)展［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào),4（6）：770-779

羅義,周啟星.2008.抗生素抗性基因（ARGs）——一種新型環(huán)境污染物［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),28（8）：1499-1505

Methods of Extraction Different Gene Types of Sediments and Water for PCR Amplification

FENG Ling，LUO Yi*

Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria,Ministry of Education,College of Environmental Sciences and Engineering,Nankai University,Tianjin 300071

1673-5897（2010）2-280-07

X502

A

羅義（1971—），女，南開大學(xué)副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事污染生態(tài)化學(xué)、分子生態(tài)毒理、分子生物標(biāo)記等方面的研究.

2009-12-13 錄用日期：2010-01-10

國家自然科學(xué)基金（No.2077704;No.30870363）；天津市自然科學(xué)基金（No.08JCYBJC02700）

馮凌（1984—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:luoy@nankai.edu.cn