陳月華，高潔，*，馬梅，饒凱鋒，李文忠，何春利，劉操

1.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715

2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

3.北京市水利科學(xué)研究所，北京100085

北京市污水廠污泥中的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)物質(zhì)

陳月華1，高潔1，*，馬梅2，饒凱鋒2，李文忠3，何春利3，劉操3

1.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715

2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

3.北京市水利科學(xué)研究所，北京100085

采用重組基因酵母法檢測(cè)了北京市16個(gè)污水處理廠污泥的雌激素、雄激素和孕激素效應(yīng).結(jié)果表明，各污水廠污泥中均可檢測(cè)到雌激素受體誘導(dǎo)效應(yīng)，范圍在0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之間.各水廠污泥均未檢測(cè)出雄激素誘導(dǎo)效應(yīng)和孕激素誘導(dǎo)效應(yīng)，大部分污水廠污泥樣品表現(xiàn)出較明顯的雄激素抑制效應(yīng)和較強(qiáng)的孕激素抑制效應(yīng).與國外相比，北京市污水廠污泥中的雌激素活性值相對(duì)較低.堆肥處理不能有效去除雌激素類物質(zhì)和孕激素抑制物質(zhì)，但對(duì)雄激素抑制物質(zhì)的去除明顯.

內(nèi)分泌干擾物；生物測(cè)試；污水廠污泥

Received 8 January 2010 accepted 15 February 2010

Abstract：This study tested for estrogenic effect,androgenic effect and progestogenic effect of sewage sludge from sixteen sewage treatment plants in Beijing using a recombinant yeast bioassay.Estrogenic activity can be detected for all the sewage sludge,with rang from 0.587 to 6.76ngEEQ·g-1（dw）of estradiol equivalent.None of samples showed androgenic activity and progestogenic activity.However,major part of samples showed obviously inhibitory effect for androgen,and strong inhibitory effect for progestogen.In general,the estrogenic activity in the sludge in Beijing was lower than those reported elsewhere.The composting process could not remove efficiently estrogen-like chemicals or progestogenic inhibitors, but could remove efficiently androgenic inhibitor from sewage sludge.

Keywords：endocrine disruptive chemicals；bioassay；sewage sludge

1 引言（Introduction）

污水廠污泥的環(huán)境污染問題一直以來都是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn).近年來隨著內(nèi)分泌干擾物在水體中的廣泛分布，以及人們對(duì)污水處理過程中內(nèi)分泌干攏物去除機(jī)制的認(rèn)識(shí)（杜兵等，2004），隨污泥排放進(jìn)入環(huán)境的內(nèi)分泌干擾物問題引起了人們的高度重視.早期的一些研究已經(jīng)證實(shí)污泥具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng).Waring等（1996）將污水處理廠污泥暴露于蝦虎魚、虎刺魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%的雌性蝦虎魚產(chǎn)卵受到明顯的抑制.Paul等（2005）發(fā)現(xiàn)在施用污泥的牧場(chǎng)上，公綿羊幼崽睪丸發(fā)育下降，內(nèi)分泌系統(tǒng)也呈現(xiàn)失調(diào)狀態(tài)，而且影響持續(xù)至其成年期.伴隨著污泥的環(huán)境內(nèi)分泌問題的相繼報(bào)道及污泥安全回用的呼聲日益高漲，對(duì)污泥進(jìn)行內(nèi)分泌干擾效應(yīng)檢測(cè)和評(píng)價(jià)已成為一種緊迫的任務(wù).

國內(nèi)外對(duì)污泥的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究目前相對(duì)較少，僅有的研究也局限于有限的內(nèi)分泌干擾物分析.如莫測(cè)輝等（2001）和蔡全英等（2001）對(duì)我國不同城市污泥的有機(jī)污染物種類和含量進(jìn)行了分析，并研究了鄰苯二甲酸酯在污泥中的分布和含量；Cheng等（2000）分析了臺(tái)灣城市污泥中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、壬基酚（4-NP）的含量，進(jìn)一步研究了不同環(huán)境條件下好氧消化污泥中DEHP的降解情況.然而污泥是一個(gè)復(fù)雜的混合體系，由各種酚類、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、二噁惡英及鄰苯二甲酸鹽等有毒有害物質(zhì)組成，化學(xué)分析很難對(duì)污泥中為數(shù)眾多的污染物進(jìn)行逐一定量.生物測(cè)試方法簡便、快速、靈敏，能綜合評(píng)價(jià)環(huán)境樣品的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境水樣的內(nèi)分泌干擾檢測(cè)（饒凱鋒等，2005;李劍等，2006;崔青等，2007）.

本研究采用重組人雌激素受體基因酵母、重組人雄激素受體基因酵母和重組孕激素受體基因酵母檢測(cè)了北京市16個(gè)污水處理廠共17個(gè)污泥樣品的雌激素效應(yīng)、雄激素效應(yīng)和孕激素效應(yīng)，以期對(duì)北京市主要污水廠污泥的內(nèi)分泌干擾物排放水平有一個(gè)大致的估算.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 樣品前處理

污泥樣品于2009年10月采集自北京市16個(gè)污水處理廠，以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P表示.除D廠采集了生污泥和堆肥后消化污泥外，其它污水處理廠采集的均是生污泥.

采集的污泥經(jīng)冷凍干燥（FD21冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康技術(shù)公司）后，研磨成粉末，過40目篩，避光保存.準(zhǔn)確稱取1g污泥，用100mL丙酮：二氯甲烷（體積比為1：1）的混合液在索氏提取器中先浸泡過夜，再抽提24h.提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）濃縮至1～2mL后，轉(zhuǎn)移至K-D濃縮器中，氮吹，最后加入500μL二甲基亞砜（DMSO）溶解.每個(gè)樣品均稀釋至6個(gè)濃度梯度，-20℃保存以待生物測(cè)試.

2.2 酵母菌的凍存與復(fù)蘇

重組孕激素受體基因酵母由Gaido教授贈(zèng)送，采用添加有硫酸酮、腺嘌呤、賴氨酸、色氨酸的SC培養(yǎng)基.重組雌激素受體基因酵母和重組雄激素受體基因酵母為本實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建，為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有人雌激素基因片斷hER或人雄激素基因片斷hAR和共激活因子GRIP1的雙雜交酵母，主要采用缺乏亮氨酸和色氨酸的SD培養(yǎng)基.

將1mL新鮮凍融的酵母菌液加入到30mL培養(yǎng)液中，30℃、150rpm培養(yǎng)過夜.取過夜培養(yǎng)的菌液稀釋10倍于600nm處測(cè)定吸光度值，要求菌液的OD600為0.6～0.8.向培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為15%的無菌甘油，以1mL分裝于EP管中，按4℃→-20℃→-80℃逐步降溫，最后保存在-80℃冰箱中（莊麗麗等，2010）.

2.3 重組基因酵母測(cè)試

重組基因酵母測(cè)試方法參考以前的文獻(xiàn)（李劍等，2008;Ma et al.,2005;Li et al.,2008）.將過夜培養(yǎng)的菌液進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其吸光度至0.75左右.將995μL的酵母菌液與5μL的樣品渦旋混勻.取200μL的混合液加入到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)至少3個(gè)平行測(cè)試.同時(shí)每板設(shè)定陽性對(duì)照（2×10-10mol·L-1的17β-雌二醇或5×10-8mol·L-1的二氫睪酮或10-9mol·L-1的孕酮，分別對(duì)應(yīng)于重組雌激素、重組雄激素和重組孕激素酵母）和陰性對(duì)照（DMSO）.為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，所有樣品均做重復(fù)實(shí)驗(yàn).將96孔板置于微孔搖床（Heidolph TITRAMAX 1000,Hamburg,Germany）上，30℃、800rpm暴露培養(yǎng) 2h.以上均為無菌操作.測(cè)定 OD595的值（酶標(biāo)儀 Tecan,GENios,Austria）.將培養(yǎng)板中的菌液吸出 150μL，加入120μL分析緩沖液（每100mL的基礎(chǔ)緩沖液中加入3.33mL濃度為0.1%的SDS溶液和270μL β-巰基乙醇.基礎(chǔ)緩沖液的配制：將 21.51g的Na2HPO4·12H2O、6.22g的 NaH2PO4·2H2O、0.75g的KCl和0.25g的MgSO4·7H2O溶解并定容于1L的蒸餾水中），30℃、800rpm繼續(xù)培養(yǎng)10min后加入20μL氯仿，于搖床上1300rpm振蕩10min破碎酵母細(xì)胞.加入40μL O-NPG（13.3mmol·L-1，溶解于基礎(chǔ)緩沖液中）啟動(dòng)酶反應(yīng)，計(jì)時(shí)直至出現(xiàn)明顯的黃色.反應(yīng)完成后加入100μL碳酸鈉（1mol·L-1）終止.吸取200μL轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，測(cè)定OD420值.

檢測(cè)樣品的抗激素效應(yīng)則需將990μL的菌液與5μL樣品及5μL標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑（5×10-8mol·L-1的二氫睪酮或10-9mol·L-1的孕酮）共暴露培養(yǎng)，其它步驟與上述一致.

2.4 數(shù)據(jù)分析

β-半乳糖苷酶活性u(píng)值的計(jì)算：

式中：u為β-半乳糖苷酶活性（U）；t為酶反應(yīng)時(shí)間（min）；V為反應(yīng)體積（mL）；D為稀釋因子；OD′420為陰性對(duì)照在420nm處的吸光度值；OD420和OD595為樣品在420nm和595nm處的吸光度值.

樣品的雄激素效應(yīng)和孕激素效應(yīng)均以誘導(dǎo)率和抑制率表征，公式如下：

式中：u（s）為樣品誘導(dǎo)酵母產(chǎn)生的酶活性值；u（p）為陽性對(duì)照（二氫睪酮、孕酮）誘導(dǎo)酵母產(chǎn)生的酶活性值（莊麗麗等，2010）.

樣品的雌激素效應(yīng)用17β-雌二醇標(biāo)定：將樣品的酶活與實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的17β-雌二醇的劑量-酶活關(guān)系曲線對(duì)比后得到雌二醇當(dāng)量值（EEQ）（李劍等，2008）.

雄激素誘導(dǎo)率和抑制率及孕激素誘導(dǎo)率和抑制率均以0.5mg污泥所誘導(dǎo)或抑制的β-半乳糖苷酶活性計(jì)算.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 重組基因酵母體外測(cè)試

利用重組雌激素受體、雄激素受體和孕激素受體的酵母分別檢測(cè)了17β-雌二醇、二氫睪酮、孕酮的效應(yīng)，通過函數(shù)擬合方程計(jì)算出EC50值（表1），與文獻(xiàn)報(bào)道的該3種物質(zhì)在重組基因酵母中的結(jié)果類似（Rehmann et al.,1999;Sohoni and Sumpter, 1998;Death et al.,2004）.

表1 重組基因酵母檢測(cè)已知誘導(dǎo)劑的半數(shù)濃度Table 1 EC50values of the known agonists in the recombinant yeast bioassay

3.2 污泥樣品的重組基因酵母檢測(cè)

圖1 17個(gè)污泥樣品的雌激素受體誘導(dǎo)效應(yīng)（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產(chǎn)物）Fig.1 The inductive effect of the seventeen sewage sludge on estrogen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D;6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P;5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

17個(gè)污泥樣品的雌激素受體誘導(dǎo)效應(yīng)如圖1所示.污泥樣品的雌激素受體誘導(dǎo)活性用17β-雌二醇的當(dāng)量值EEQ表示.由圖1可見，17個(gè)污泥樣品雌激素受體誘導(dǎo)活性范圍在 0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之間，其中以M廠的污泥EEQ值最高，C廠、E廠和O廠的污泥EEQ值相對(duì)較低，前者數(shù)值約為后者的10倍.采集于不同污水處理廠的污泥其雌激素活性顯示出一定的差距，可能與處理水源、處理水量、處理工藝及污泥類型等有關(guān).D廠污泥雌激素活性為 2.04ngEEQ·g-1（dw），經(jīng)堆肥消化處理后雌激素活性不但沒有消失，反而有所升高，增至3.58ngEEQ·g-1（dw）.分析其原因，可能與微生物作用有關(guān).因?yàn)閺娜祟惢騽?dòng)物體內(nèi)排出的雌激素是以非活化的共軛結(jié)合態(tài)形式存在（主要是葡糖酸苷和硫酸鹽形式），而伴隨著動(dòng)物排泄而進(jìn)入環(huán)境中的大腸桿菌能合成β-葡糖酸苷酶（Dray et al.,1972），通過降解葡糖酸苷解開共軛鍵使雌激素重新活化，雌激素效應(yīng)得以增加.研究發(fā)現(xiàn)污水處理過程能夠釋放結(jié)合態(tài)的雌激素（Desbrow et al.,1998;Tyler and Routledge, 1998;Allen et al.,1999;Ternes et al.,1999）.經(jīng)過堆肥處理后，結(jié)合態(tài)的雌激素被進(jìn)一步釋放，所以消化后的污泥雌激素活性有一定的提高.據(jù)此，可以考慮在污泥樣品的前處理過程中加入活化的步驟，使結(jié)合態(tài)的雌激素得以全面釋放，以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)值.另外，Ternes等（2002）在研究污泥的內(nèi)分泌效應(yīng)過程中也發(fā)現(xiàn)，雌激素類物質(zhì)可以伴隨著整個(gè)污泥消化過程.

Motoyama等（2006）用酵母雙雜交法檢測(cè)了21種由污泥和牲畜糞便制成的混合肥料的雌激素效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)13種具有明顯的雌激素活性.基于人雌激素受體的雙雜交酵母檢測(cè)值為14～168pmol·L-1（EEQ），比本研究的結(jié)果要高一些.原因可能是混和肥料里除了污泥外，還添加有牲畜糞便，而牲畜糞便是環(huán)境激素的一個(gè)重要來源.為了促進(jìn)牲畜的生長，飼料里添加了許多促生長劑包括雌激素類物質(zhì)，這些物質(zhì)隨牲畜的排泄物進(jìn)入周圍環(huán)境.文獻(xiàn)報(bào)道的德國兩個(gè)污水處理廠的活性污泥中雌激素的含量分別為5ng·g-1和17ng·g-1（Ternes et al.,2002），也高出本研究的結(jié)果.

一些環(huán)境污染物既能模擬內(nèi)源激素與受體結(jié)合誘導(dǎo)基因表達(dá)，也能與內(nèi)源激素競(jìng)爭核受體抑制基因表達(dá)，即同時(shí)表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)與抑制效應(yīng).鑒于此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了樣品的雄激素誘導(dǎo)效應(yīng)和抑制效應(yīng)及孕激素的誘導(dǎo)效應(yīng)和抑制效應(yīng).表2結(jié)果顯示，除D廠污泥堆肥、G廠污泥和O廠污泥未檢出雄激素誘導(dǎo)活性外，其余水廠污泥均顯示一定程度的雄激素活性；反之，除A廠、E廠、H廠、I廠和M廠的污泥檢測(cè)出孕激素誘導(dǎo)活性外，其余水廠污泥均未檢出此效應(yīng).各樣品雄激素誘導(dǎo)率和孕激素誘導(dǎo)率均在10%以下（表2），因此17個(gè)樣品均不顯示顯著的雄激素誘導(dǎo)效應(yīng)和孕激素誘導(dǎo)效應(yīng)（Hamers et al.,2006）.在Motoyama等（2006）的研究中也發(fā)現(xiàn)，21種由污泥制成的混合肥料中僅2種表現(xiàn)出雄激素活性，總活性值范圍在5～75pmol·L-1（以二氫睪酮當(dāng)量值A(chǔ)Eq表示）之間，雄激素活性值與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似.家畜排放的激素中，孕激素的量遠(yuǎn)大于雄激素，雌激素則相對(duì)較少（Lange et al.,2002）.然而孕激素在污水中更易降解（Labadie and Budzinski,2005）；另據(jù)報(bào)道經(jīng)活性污泥處理48h后，也有超過50%的孕激素被降解（Norpoth et al.,1973），這可能是污泥的孕激素誘導(dǎo)活性值較低的原因.

表2 北京城市污泥的雄激素誘導(dǎo)效應(yīng)和孕激素誘導(dǎo)效應(yīng)Table 2 The androgenic activity and progestogenic activity of municipal sludge in Beijing

抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄激素受體抑制效應(yīng)除C廠污泥未檢出外，其余樣品均有檢出（圖2）；孕激素受體抑制效應(yīng)除A廠污泥未檢出外，其余樣品均顯示較強(qiáng)的效應(yīng)（圖3）.D廠污泥經(jīng)堆肥處理后，雄激素抑制率在10%以下，抑制效果已不明顯，說明堆肥消化處理在雄激素抑制物質(zhì)的去除中起到了關(guān)鍵的作用（圖2）.但堆肥消化處理對(duì)孕激素抑制物質(zhì)的去除并不顯著（圖3）：孕激素抑制率僅由消化前的66.62%降低到消化后的57.48%，因而認(rèn)為堆肥處理不能有效去除孕激素抑制物質(zhì).

內(nèi)分泌干擾物對(duì)動(dòng)植物及人類具有一定的毒害，有關(guān)這方面的研究報(bào)道已有不少.王曉娟等（2003）發(fā)現(xiàn)添加有酞酸酯類化合物鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的擬南芥莖段愈傷組織誘導(dǎo)率低；顯微切片結(jié)果顯示DBP會(huì)干擾擬南芥試管的形態(tài)發(fā)生.Norrgren等（1993）、Engwall等（1994）、袁秀平等（1999）和張鳳君等（2001）都在研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境激素進(jìn)入魚體時(shí)，魚體的代謝會(huì)受到影響尤其是肝臟受到損傷；對(duì)于性腺的影響主要表現(xiàn)為雌化、兩性、畸形等.除此之外，內(nèi)分泌干擾物能引起人的神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙，對(duì)免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的影響也較大.污泥農(nóng)用如今已成為世界各國主要的污泥處置方式.若將本研究中的污泥不經(jīng)過處理直接農(nóng)用，污泥中的內(nèi)分泌干擾物會(huì)通過植物的根系吸收與污泥中的營養(yǎng)元素一起進(jìn)入植物體內(nèi)，影響植物的生長發(fā)育.因?yàn)榇蠖鄶?shù)內(nèi)分泌干擾物具有親脂性或不易降解性，所以通過生物富集和食物鏈的逐級(jí)放大作用最后可能造成體內(nèi)蓄積，進(jìn)而影響人類健康及生態(tài)系統(tǒng)的平衡.污泥的堆肥處理是一種較普遍的資源化利用方式.但本研究發(fā)現(xiàn)污泥經(jīng)堆肥處理后其所含的內(nèi)分泌干擾物并不能夠完全去除：孕激素抑制物質(zhì)仍然存在，雌激素類物質(zhì)反而有所增加.因而進(jìn)一步推測(cè)，污泥堆肥化制成的復(fù)合肥在一定程度上存在著潛在的危害性.

圖2 17個(gè)污泥樣品的雄激素受體抑制效應(yīng)（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產(chǎn)物）Fig.2 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on androgen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

圖3 17個(gè)污泥樣品的孕激素受體抑制效應(yīng)（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產(chǎn)物）Fig.3 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on progesterone receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

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The Endocrine Disrupters of Municipal Sewage Sludge in Beijing

CHEN Yue-hua1，GAO Jie1，*，MA Mei2，RAO Kai-feng2，LI Wen-zhong3，HE Chun-li3，LIU Cao3
1.College of Agronomy and Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
3.Beijing Hydraulic Research Institute,Beijing 100085

1673-5897（2010）2-215-07

X882.5，X131.3

A

高潔（1959—），女，博士，西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生態(tài)學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)等的研究.

2010-01-08 錄用日期：2010-02-15

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863） 探索導(dǎo)向項(xiàng)目（No.2007AA06Z414）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863） 項(xiàng)目（No. 2007AA06A407）；北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.KY-2009-03）

陳月華（1983—），女，碩士研究生，E-mail:waic2009@sina.com；*通訊作者（Corresponding author），E-mail: gaojiexn@sohu.com