李從軍，謝愛娣

1(湖北生物科技職業(yè)學院生物工程系，湖北武漢，430070)

2(湖北工業(yè)大學工程技術學院生化系，湖北武漢，430068)

酵母提取液中谷胱甘肽定量測定方法的比較

李從軍1，謝愛娣2

1(湖北生物科技職業(yè)學院生物工程系，湖北武漢，430070)

2(湖北工業(yè)大學工程技術學院生化系，湖北武漢，430068)

對ALLOXAN法、DTNB法和亞硝基鐵氰化鈉3種方法進行了改進與比較。結果表明，DTNB法用于酵母提取液中谷胱甘肽的測定具有顯著優(yōu)勢。研究了不同因素對測定結果的影響，得出了合適的測定條件。DTNB法準確度和精確度良好，回收率和理論回收率無顯著差異，且添加甲醛后DTNB法能消除半胱氨酸的干擾，是一種低成本、簡單、快速的用于酵母提取液中還原型谷胱甘肽測定的方法。

谷胱甘肽，測定，酵母提取液

谷胱甘肽(GSH)作為細胞內唯一的含巰基的三肽在細胞生物學中發(fā)揮著非常關鍵的作用[1］，在食品工業(yè)、醫(yī)藥臨床和運動營養(yǎng)學上具有廣泛的應用。目前谷胱甘肽的生產方法主要有萃取法、發(fā)酵法、酶法和化學合成法[2］。由于微生物發(fā)酵法與其他方法相比具有明顯的優(yōu)越性，是今后生產谷胱甘肽的主要趨勢，也是目前為止最具潛力的方法。而測定發(fā)酵提取液中谷胱甘肽是一個復雜的問題，谷胱甘肽穩(wěn)定性受到溫度和pH值等環(huán)境因素的限制。此外，生物樣品的組成往往十分復雜，其中包括各種蛋白質、氨基酸、多肽及其它非蛋白類物質，這些物質對谷胱甘肽的測定常常有很大的影響。谷胱甘肽的這種不穩(wěn)定性以及生物樣品組成成分的復雜性使得它的檢測方法必須具有簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定的特點。

測定谷胱甘肽含量的方法有多種，主要包括碘量法、紙層析法、差熱分析法、高效液相色譜法、分光光度法、酶法、高效毛細管電泳法、熒光法等。分光光度法具有操作簡便、靈敏度較高、不需要特殊的設備等優(yōu)點，在實驗室得到了廣泛的應用。本文改進和比較了3種基于巰基反應為原理的分光光度測定法，并對其測定條件進行了詳細的研究，建立了一種簡便、快速、經濟的測定酵母提取液中谷胱甘肽含量的方法。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

產朊假絲酵母、甜酒酵母、啤酒酵母、安琪酵母、面包酵母、釀酒酵母，由本實驗室保藏。

1.1.2 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO42 g/L，Mg-SO41 g/L，pH值自然。

1.1.3 GSH提取液的制備

采用溫差破碎法提取細胞內的GSH。取酵母發(fā)酵液9 mL，4000 r/min離心5 min，收集菌體，加3 mL去離子水攪拌均勻，-20℃冰凍過夜，沸水浴5 min，6000 r/min離心10 min，上清液即待測的GSH提取液。

1.2 主要試劑

GSH標準品;5，5＇-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(簡稱DTNB);四氧嘧啶;亞硝基鐵氰化鈉;甘氨酸，半胱氨酸;Tris。

1.3 主要儀器

UV-240全波段掃描儀;UNICO UV-2100紫外可見分光光度計;Anke TGL-16G高速冷凍離心機;Mettler AE100分析天平;恒溫水浴鍋;控溫搖床;微量移液槍。

1.4 測定方法

1.4.1 ALLOXAN試劑法

1.4.1.1 試劑

ALLOXAN試劑:稱取四氧嘧啶1.0 g，用 0 .1 mol/L的HCl溶液定容至1 L，低溫保存;0.1 mol/L甘氨酸溶液;0.24 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.6);200 mg/L GSH標準液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

1.4.1.2 操作步驟

[3］，改進后按照表1進行。

1.4.2 DTNB法

1.4.2.1 試劑

0.25 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液;φ=0.03甲醛溶液(用NaOH調節(jié)pH值8.0);0.01 mol/L DTNB儲存液:由DTNB加0.05 mol/L pH值7的磷酸鹽緩沖液配制，存于棕色瓶中，放于低溫暗處備用;DTNB分析液:由1體積0.01 mol/L DTNB儲存液加100體積的0.5 mol/L、pH值8.0的Tris-HCl緩沖液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配;200 mg/L GSH標準液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

表1 ALLOXAN試劑法操作步驟

1.4.2.2 操作步驟

按參考文獻[4］，略作改進后按表2進行。

表2 DTNB法操作步驟

1.4.3 亞硝基鐵氰化鈉法

1.4.3.1 試劑

亞硝基鐵氰化鈉試劑:稱取亞硝基鐵氰化鈉1.5 g，溶于飽和硫酸銨溶液中使成100 mL，此試劑僅能保存1 w;固體硫酸銨;8 mol/L NH4OH;200 mg/L GSH標準液(蒸餾水配置，-80℃保存)。

1.4.3.2 操作步驟

按參考文獻[3］改進后，按表3進行。

表3 亞硝基鐵氰化鈉法操作步驟

2 實驗結果與討論

2.1 三種測定方法的比較

采用3種方法測得的谷胱甘肽在不同濃度時的反應曲線如圖1所示，對其進行回歸分析，得到相應的標準曲線方程(見表4)。ALLOXAN法和DTNB法標準曲線的相關系數(shù)較高，R2均能夠達到0.99以上，線性相關性良好;而亞硝基鐵氰化鈉法相關系數(shù)較低，僅為0.944，線性相關性較差。產生這種現(xiàn)象的原因是因為亞硝基鐵氰化鈉法顯色后很不穩(wěn)定，吸光值很快就下降，在測定的過程中就可見明顯下降，這給讀數(shù)帶來很大誤差。

圖1 谷胱甘肽在不同濃度時的反應曲線

表4 三種谷胱甘肽測定方法標準曲線的回歸方程

在顯色穩(wěn)定性實驗中，考察了吸光值隨時間的變化情況。表5中列出了用3種方法測定一定濃度的GSH標準液時，吸光值隨時間的變化。結果表明，在亞硝基鐵氰化鈉法中，GSH在反應顯色后生成的色澤很不穩(wěn)定，顯色后吸光值在30 s即見明顯降低，因此要求在盡可能短的時間內完成測定，而且吸光值在測定過程中不停變動，這給操作的平行性帶來很大的難度。ALLOXAN試劑法中，反應顯色后30 min以內吸光值未見降低，顯色穩(wěn)定。DTNB法反應顯色后能保持穩(wěn)定20 min。

盡管，ALLOXAN法和DTNB法對標準品的測定都有很好靈敏度、線性相關性和顯色穩(wěn)定性，但是由于ALLOXAN法測定波長在305 nm，酵母提取液中的很多物質(如核酸吸收波長260 nm，蛋白質吸收波長280 nm)吸收波長與305 nm非常接近，對測定會有很大干擾。此外，半胱氨酸與ALLOXAN試劑反應生成的產物在275 nm也有吸收，而且四氧嘧啶本身在305 nm也有少量吸收。因此，在測定酵母提取液中GSH時，ALLOXAN顯示出很多不足，而且要減去四氧嘧啶本身的背景吸收，操作起來比較繁瑣。DTNB法測定波長在412 nm，可以避免核酸、蛋白質吸收對測定的干擾，而且DTNB本身在412 nm處也沒有吸收、操作簡便、不需要貴重設備，在測定酵母提取液中谷胱甘肽含量上顯示出很大的優(yōu)勢。綜合考慮上述因素，選擇DTNB法作為實驗的測定方法，并對DTNB法作了詳細的研究，確定了DTNB法的具體操作條件。

表5 三種谷胱甘肽測定方法顯色穩(wěn)定性

2.2 DTNB法測定酵母提取液中谷胱甘肽含量

2.2.1 顯色劑DTNB的用量對體系吸光度的影響

將DTNB儲存液配制成濃度分別為(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0)×10-4mol/L DTNB分析液，測定不同濃度DTNB分析液作為顯色劑時體系的吸光度，其余條件均相同。顯色劑用量與體系吸光度之間的關系見圖2。

圖2 不同DTNB濃度的吸光值

由圖2可知，隨著顯色劑DTNB濃度的增加，體系在412 nm處的吸光度也隨之增加，當用量達到0.8×10-4mol/L以后，體系的吸光度基本保持不變。濃度過低，谷胱甘肽不能完全顯色;濃度過高，會造成藥品的浪費。故實驗中選擇DTNB分析液的濃度為1.0×10-4mol/L。

2.2.2 顯色體系穩(wěn)定性

取0.5 mL 200 mg/L GSH標準溶液，按DTNB法操作，與甲醛反應2 min后加入2.5 mL分析液，迅速混勻測定不同時間的吸光值，結果見圖3。由圖3可知，顯色反應1.5 min達到最大值，顯色體系在1.5～20 min內吸光度基本穩(wěn)定，超過20 min后，吸光度開始逐漸下降，考慮到由于冬夏室溫變化，加入試劑水浴后吸光值達最大所需要的時間可能會有差異，故實驗中選擇5 min為顯色時間，在20 min內完成試樣的測定。

圖3 不同顯色時間下DTNB法吸光值

2.2.3 標準品和提取液掃描圖譜

分別對標準品和提取液進行200～500 nm波段掃描，由掃描圖(圖4)可知，標準品和提取液最大吸收峰均在412 nm，提取液中還存在260～280 nm的核酸與蛋白的吸收峰，但與412 nm相差較遠，不會干擾測定結果。

圖4 標準品和提取液紫外-可見分光光度計掃描圖

2.2.4 標準曲線的制作

按照表2測定不同濃度谷胱甘肽顯色后的吸光值，如圖1(B)，對測定結果進行回歸分析得標準曲線方程為y=272.99x+1.5859，相關系數(shù)R2=0.9997，說明GSH濃度在0～200 mg/L與412 nm吸光值呈良好線性關系。

2.2.5 半胱氨酸對谷胱甘肽測定的干擾試驗

半胱氨酸為谷胱甘肽合成的前體，而且酵母提取液中還存在一些其他的含巰基的物質，這些物質的巰基也能和DTNB反應。本方法根據甲醛與半胱氨酸和GSH反應速率的不同，采用合適的甲醛濃度來消除半胱氨酸等含巰基的化合物對GSH測定的干擾。

2.2.5.1 甲醛同Cys和GSH反應速率

半胱氨酸標準溶液(約1 g/L)和GSH標準溶液(200 mg/L)，按照DTNB法分別與φ=0.03甲醛反應不同時間后測定吸光度，以水代替甲醛作為對照。

表6 甲醛同Cys和GSH的反應速率

由表6可知，甲醛與半胱氨酸反應較快，而與谷胱甘肽反應較慢。3%的甲醛在2 min之內，幾乎將半胱氨酸完全掩蔽，而谷胱甘肽受影響很小。本文選用φ=0.03的甲醛反應2 min作為反應條件。在此條件下，濃度高達1 g/L的半胱氨酸98%被掩蔽，而僅有1%的GSH被掩蔽，半胱氨酸的存在不會影響GSH的測定。

2.2.5.2 Cys共存時GSH含量分析

各取適量的GSH標準溶液和半胱氨酸標準溶液，按DTNB法測定表7中的樣品，同時以等體積水代替其中的半胱氨酸標準溶液作為空白對照。(A樣品-0.010)/A對照值與1.00無顯著差異，說明在半胱氨酸共存時本分析方法可行。

表7 Cys共存時GSH含量分析

2.2.6 測定方法的準確度和精確度

為了考察方法的準確度和精密度，同一酵母提取液樣品重復測定8次，計算相對誤差和相對標準偏差，由表8可知相對誤差和相對標準偏差都很小，方法的準確度和精確度都是令人滿意的。

表8 DTNB法相對誤差和相對標準偏差

2.2.7 回收率試驗

在試樣中，加入一定量的待測標準物質，然后與原試樣同時進行測定，測得結果之差應等于加入的標準物質的量。通過回收率的測定，可以檢驗方法的準確度和試樣所引起的干擾誤差。對不同酵母提取液樣品進行了回收實驗，回收率按下式計算[5］:

式中，w0為試樣中原有GSH的含量;w為試樣中加入標準GSH的含量;w1為試樣中加入標準GSH后測得的被測物的含量。

采用不同酵母提取液進行了回收率試驗，結果見表9。由表9可知，不同酵母提取液，谷胱甘肽回收率在97.254%～101.14%?；厥章试谥眯哦?5%下經t檢驗，與理論回收率無顯著差異?；厥章势骄?9.580，t=0.546﹥0.05，與理論回收率100%無顯著差異，標準偏差=1.588151。

表9 DTNB法回收率

3 結論

對3種測定谷胱甘肽的方法進行了改進和比較，綜合各方面的原因考慮，認為DTNB法對于測定酵母提取液中谷胱甘肽含量具有明顯的優(yōu)勢。對DTNB法測定方法的條件進行了研究，其線性度良好，準確度、精確度都很高，平均回收率達到99.58%，與理論回收率無顯著差異。且添加甲醛后，DTNB法能消除半胱氨酸等雜質的干擾，是一種簡便、經濟的用于酵母提取液中還原型谷胱甘肽測定的方法。

參考文獻

[1]Heather Jefferies，Jane Coster，Alizan Khalil，et al.Glutathione[J］.ANZ Surg，2003，73:517-522.

[2]蔡俊.谷胱甘肽的研究進展[J］.糧食與飼料工業(yè)，2000(10):41-42.

[3］上海醫(yī)學化驗所.臨床生化檢驗(上)[M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1979:86-88.

[4]趙旭東，魏東芝，萬群，等.谷胱甘肽的簡便測定法[J］.藥物分析雜志，2000，20(1):34-37.

[5]天津輕工業(yè)學院，無錫輕工業(yè)學院，大連輕工業(yè)學院編著.工業(yè)發(fā)酵分析(續(xù)篇)[M］.北京，中國輕工業(yè)出版社，1997:3-14.

ABSTRACTThree kinds of determination methods of glutathione were introduced and evaluated.The results showed that the DTNB method had remarkable advantages in determining glutathione of yeast extraction.The influencing factors of determination were studied and the optimum determination conditions were acquired.This method showed good veracity and precision，and had no statistically significant difference compared with theoretical recovery rate.DTNB method can avoid the disturbance of cysteine and is a simple，fast and economic method.

Key wordsglutathione，determination，yeast extraction

Comparative Study on Quantitative Determination Method of Glutathione in Yeast Extraction

Li Cong-jun1，Xie Ai-di2
1(Department of Bioengineering，Hubei Vocational College of Bio-Technology，Wuhan 430070，China)
2(Department of Biochemistry，College of Engineering and Technology，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China)

碩士研究生。

2010-02-06，改回日期:2010-04-08