熊雙麗，李安林

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

夏枯草多糖的清除自由基及抗氧化活性

熊雙麗，李安林

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

以夏枯草多糖提取率為考察指標(biāo)，用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定夏枯草多糖的最佳提取工藝，并測定多糖的自由基清除活性和脂質(zhì)過氧化抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：影響多糖提取率最主要的因素是料液比，其次是提取溫度和時(shí)間。最優(yōu)工藝條件為提取溫度90℃，時(shí)間4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率達(dá)5.39%。夏枯草多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除作用，以及卵磷脂脂質(zhì)過氧化損傷抑制作用較強(qiáng)，在濃度為0.8 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)96.25%，濃度為0.5 mg/mL，DPPH自由基清除率達(dá)68.81%。前兩者的清除能力隨著夏枯草多糖濃度升高而增強(qiáng)，并呈明顯的量效關(guān)系，但當(dāng)濃度超過一定值時(shí)，結(jié)果卻相反。而多糖對(duì)卵磷脂脂質(zhì)過氧化損傷的抑制作用一直呈正相關(guān)。

夏枯草；多糖；自由基

Abstract:This article mainly adopted orthogonal design experiment to optimize extracting technology of polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn by using extraction rate as objective index,also determined the property of free radcial such as hydroxyl free radical and DPPH free radical and lipid peroxidation-inhibiting effect.The results exhibited that solid-liquid ratio is most important factor for the extraction percentage of the polysaccharides,the time and temperature are the second.The optimal extraction technology conditions are：temperature 90 ℃,extraction time 4 h,solid-liquid ratio 1∶35.The yield of the polysaccharides is 5.39%.The polysaccharide has good capability to scavenge the hydroxyl free radical and DPPH free radical,and the scavenging capability is obviously related to the concentrations.However,the results are contrary when concentration is excessive.The hydroxyl free radical-scavenging rate is 96.25%at the concentration of 0.8 mg/mL,while the DPPH free radical-scavenging rate is 68.81%at the concentration of 0.5 mg/mL.Polysaccharide also inhibits lipid peroxidation of lecithinum,which is also dependent on its concentration.

Key words：Prunella vulgaris Linn；polysaccharide；free radical

自由基醫(yī)學(xué)研究表明，當(dāng)機(jī)體的氧化與抗氧化處于一種動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，自由基是機(jī)體內(nèi)不可缺少的活性物質(zhì)，作為第二信使參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。而在患病或衰老等狀態(tài)下，自由基水平明顯升高，從而導(dǎo)致或加重許多疾病的發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣硬化、肝病、糖尿病、癌癥、老年癡呆癥[2-3]。目前由于一些合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚被發(fā)現(xiàn)有不同程度的致癌等毒副作用，因而在美國和日本已停止使用。目前，天然植物抗氧化劑日益成為研究的熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品和化妝品等行業(yè)[4-5]。夏枯草（Prunella vulga ris Linn）為唇形科植物,全球約15種，在我國主產(chǎn)于湖南、安徽、浙江、江蘇。其主要成分含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、揮發(fā)油及糖類等[6]。目前報(bào)道得較多的是夏枯草小分子化合物的分離和生物活性，以及多糖的抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[7]。而對(duì)該多糖的工藝和自由基清除，以及抗氧化活性鮮見報(bào)道。本文主要優(yōu)化夏枯草多糖的提取工藝，測定該多糖的羥基自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和脂質(zhì)過氧化抑制活性，為夏枯草新型功能食品的開發(fā)和進(jìn)一步的綜合利用提供理論參考。

1 材料與儀器

原料：夏枯草：成都藥店。

主要試劑：DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基；2,2-diphenyl-1-picry-hydrazyl radical）；卵磷脂：Sigma公司，硫代巴比妥酸、水楊酸、三氯乙酸等皆為分析純。

主要儀器：TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MODULYOD冷凍真空干燥機(jī)：美國Thermo Electron公司；DZF-6020真空干燥箱：上海一恒儀器廠。

2 方法

2.1 夏枯草多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 夏枯草的預(yù)處理

稱取一定量夏枯草粉末，用乙醇回流處理4 h，回流2次，以去掉部分醇溶性雜質(zhì)如黃酮、色素、低聚糖等物質(zhì)。再將回流后的殘?jiān)栏珊筮M(jìn)行多糖提取。

2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以往研究發(fā)現(xiàn)提取溫度、時(shí)間、料液比對(duì)夏枯草多糖提取率影響較大。本文主要以提取液中多糖提取率為指標(biāo)，采用三因素三水平以優(yōu)化多糖的最佳提取工藝，正交設(shè)計(jì)方案如表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 The factors and levels of orthogonal design experiment

2.1.3 夏枯草多糖含量測定

總糖測定：采用硫酸-苯酚法（以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品）[8]。

還原糖測定：3,5-二硝基水楊酸測測定法[8]。

2.1.4 夏枯草多糖提取工藝

夏枯草全草粉→60℃烘干→粉碎過篩（40目）→乙醇去醇溶性物質(zhì)2次→90℃攪拌提取4 h→50℃真空減壓濃縮→大孔非極性吸附樹脂HZ-820脫色→乙醇沉淀→50℃真空烘干→粗多糖M，以測定其自由基清除活性和抗氧化活性。

2.2 夏枯草多糖羥基自由基清除活性[9]

羥基自由基體系中加入水楊酸，生成有色物質(zhì)2,3-二羥基苯甲酸，在此體系中加入具有清除羥基自由基（·OH）的被測物，從而使有色產(chǎn)物生成量減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在相同體積的反應(yīng)體系中8.8 mmol/L H2O2、6 mmol/L Fe2+和 6 mmol/L 水楊酸乙醇溶液）中加入一系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的夏枯草多糖溶液，并用去離子水作為參比，與試劑空白液比較，在510 nm處測量各質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的吸光值，按下式計(jì)算夏枯草多糖的羥基自由基清除率：

式中：R為被測液對(duì)·OH的清除率；Ai為加試樣和水楊酸溶液體系反應(yīng)后溶液吸光度；Aj為不加水楊酸體系，只加試樣的溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加水楊酸體系的吸光值。

2.3 夏枯草多糖DPPH自由基清除活性[10]

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm處有強(qiáng)烈吸收，在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)，而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線形關(guān)系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。按下式計(jì)算夏枯草多糖對(duì)DPPH自由基的清除率：

式中：K為被測液對(duì)DPPH自由基的清除率；Ai為加試樣反應(yīng)后DPPH溶液吸光度；Aj為不加DPPH，只加試樣的溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加DPPH的溶液的吸光度。

2.4 抑制脂質(zhì)體過氧化能力[11-12]

2.4.1 試劑的配制

脂質(zhì)體PBS分散系（LLS）：300 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L pH=7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲波處理30 min，冰浴保存；三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸（TCA-TBA-HCl） 混合液∶15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL濃鹽酸依序溶于100 mL水中。

2.4.2 抑制脂質(zhì)體過氧化能力的測定

于樣品管中依次加入1 mL LLS、1 mL 400 μmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL樣品，混勻，避光，于37℃水浴中保持60min，再加入2mLTCA-TBA-HCl混合液，100℃水浴中反應(yīng)15 min，冰水中迅速冷卻，以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液在535 nm測定吸光值A(chǔ)s?？瞻坠芤? mL去離子水代替1 mL樣品，操作方法同樣品管,可測得空白管的吸光度Ac。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率 S=[(Ac-As)/Ac]×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 夏枯草多糖提取的工藝條件

夏枯草多糖提取的工藝條件見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The orthogonal design experiment and results of polysaccharide extraction

從表2可以看出，時(shí)間、溫度和料液比對(duì)總糖和多糖提取率影響較大，而對(duì)還原糖提取率幾乎無影響，說明夏枯草多糖耐熱性好，受提取溫度和時(shí)間影響小。正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果表明各因素對(duì)夏枯草多糖提取率影響的順序?yàn)椋毫弦罕龋緶囟龋緯r(shí)間。最優(yōu)水平組合為溫度90℃,提取時(shí)間4 h，料液比1∶35（g/mL），多糖提取率5.39%。

3.2 夏枯草多糖對(duì)羥基自由基的清除活性

夏枯草多糖對(duì)羥基自由基的清除活性見圖1。

在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種自由基，·OH和超氧陰離子自由基具有廣泛代表性，后者形成最早，前者的反應(yīng)活性最強(qiáng)，對(duì)機(jī)體危害最大[13]，因?yàn)椤H是僅次于F-的強(qiáng)氧化劑，幾乎可以和所有的細(xì)胞組分(核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)發(fā)生反應(yīng)，對(duì)于篩選、評(píng)價(jià)具有清除自由基能力的生化藥品和功能食品有著重要意義。圖1顯示，夏枯草多糖具有較強(qiáng)的自由基清除活性，在多糖濃度為0.8 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)96.25%。在一定的濃度范圍內(nèi)，夏枯草多糖的羥基自由基清除活性隨濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度超過0.9 mg/mL時(shí)，效果卻相反。該多糖·OH清除活性高于一般其它植物多糖，而且濃度過高，效果卻越差，這也與其它植物多糖不同[14]，有待進(jìn)一步研究。

3.3 夏枯草多糖對(duì)DPPH自由基的清除活性

夏枯草多糖對(duì)DPPH自由基的清除活性見圖2。

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的非水溶性化學(xué)自由基，常用來評(píng)價(jià)活性物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力[15]。圖2顯示，不同濃度夏枯草多糖對(duì)DPPH自由基清除活性隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，當(dāng)時(shí)間超過35 min時(shí)，自由基清除率幾乎不再增加。DPPH自由基清除率也是隨濃度的增加而增加，當(dāng)超過0.7 mg/mL時(shí)，清除率降低，與羥基自由基清除效果一致。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL，在35 min時(shí)，DPPH自由基清除率最高，達(dá)68.81%。

3.4 夏枯草多糖抑制脂質(zhì)過氧化作用

夏枯草多糖抑制脂質(zhì)過氧化作用見圖3。

選擇常用的由Fe2+引發(fā)的卵磷脂磷酸緩沖液分散系，通過檢測卵磷脂的氧化產(chǎn)物——過氧化物經(jīng)分解產(chǎn)生的二級(jí)產(chǎn)物丙二醛來衡量脂質(zhì)體的氧化程度。在酸性條件下，卵磷脂可被·OH氧化損傷產(chǎn)生丙二醛（MDA）類似物，硫代巴比妥酸（TBA）可與MDA類似物反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm處有最大光吸收，加入夏枯草多糖后，可有效抑制MDA的生成，進(jìn)而反映夏枯草多糖的抗脂質(zhì)過氧化作用。圖3顯示，在所測定的濃度范圍內(nèi)，夏枯草多糖對(duì)由Fe2+引發(fā)的卵磷脂分散系過氧化的抑制能力均隨其濃度的增大而增大，在其加入量較小(濃度較低)時(shí)，加入量與清除率表現(xiàn)出量效關(guān)系，當(dāng)濃度增大到一定值時(shí)，清除率隨濃度的增加而呈微小變化。

4 結(jié)論

經(jīng)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化，用水提醇析法提取夏枯草多糖的最佳工藝條件為：提取溫度90℃，料液比1∶35（g/mL），提取時(shí)間 4 h，多糖提取率可達(dá) 5.39%。夏枯草多糖對(duì)羥自由基·OH和·DPPH的清除作用較強(qiáng)，前者在濃度為0.8 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)96.25%，后者濃度為0.5 mg/mL，達(dá)68.81%。兩者的清除能力隨著夏枯草多糖濃度增加而升高，并呈明顯的量效關(guān)系，但當(dāng)濃度超過一定值時(shí)，結(jié)果卻相反。夏枯草多糖對(duì)卵磷脂脂質(zhì)過氧化損傷有顯著抑制作用，也呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。為夏枯草作為天然抗氧化劑的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，而夏枯草多糖中主要表現(xiàn)抗氧化活性的具體級(jí)分和構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

[1]景亞武,易靜,高飛，等.活性氧：從毒性分子到信號(hào)分子-ROS與細(xì)胞的增殖,分化和凋亡及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2003,25(4)：197-202

[2]VALKO M,LEIBRITZ D,MONCOLAFREE J，et al.Free radicals andantioxidantsinnormalphysiologicalfunctionsandhumandisease[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology，2007,39(1)：44-84

[3]LU T,FINKEL T.Free radicals and senescence[J].Experimental Cell Research,2008,314(9)：1918-1922

[4]PAN YM,L IANG Y,WANG H S,et al.Antioxidant activity of severalChinesemedicineherbs[J].FoodChemistry,2004,88(3)：347-350

[5]李姣娟,黃克瀛,龔建良,等.油茶葉乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(2)：82-86

[6]馮怡,薛明,姜玲,等.海夏枯草中水溶性多糖的分離純化及化學(xué)研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志2008,28(6)：431-435

[7]封亮，賈曉斌，陳彥夏，等.枯草化學(xué)成分及抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(5)：428-434

[8]張惟杰.糖復(fù)合物生化技術(shù)[M].浙江：浙江大學(xué)出版社，1999：9-12

[9]程超,李偉,莫開菊,等.不同火棘多酚的體外自由基清除作用[J].中國釀造,2008(10)：39-42

[10]QIAN JY,LIU D,HUANG AG.The efficiency of flavonoids in polar extracts of lycium chinense mill fruits as free radical scavenger[J].Food Chemistry,2004,87(2)：283-288

[11]呂曉玲,邱松山,孫曉俠,等.油茶總皂苷的抗氧化及清除自由基能力初步研究[J].食品科學(xué),2005,26(11)：86-90

[12]OCK-SOOK Y,MEYER AS,FRANKEL E.AntioxidantActivity of GrapeExtractsinaLecithinLiposomeSystem[J].JAOCS,1997,74(10)：1301-1306

[13]Halliwell B.Reactive oxygen species and the central nervoussystem[J].J Neurochem,1992,59(5)：1609-1623

[14]王新，何玲玲，劉彬.苦丁茶冬青葉多糖的分離純化及其對(duì)羥自由基的清除作用[J].食品科學(xué),2008,29(6)：37-40

[15]BONDET V,BRAND-WILLIANS W,BERSET C.Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method[J].Lebensmittel-Wissenschaft und-Technology,1997,30(6)：609-615

Free Radical-Scavenging and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Prunella Vulgaris Linn

XIONG Shuang-li,LI An-lin
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-20

西南科技大學(xué)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)培育項(xiàng)目(07JGZB18)

熊雙麗（1977—），女（漢），副教授，博士，研究方向：碳水化合物與生物技術(shù)。