張 慧，吳 穎，路 勇，張衛(wèi)民，姜 潔，馮 楠，謝文東

（1.北京市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，北京100026；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041）

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蘋果中的赤霉素、脫落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑殘的殘留量

張 慧1，吳 穎1，路 勇2，張衛(wèi)民2，姜 潔2，馮 楠2，謝文東2

（1.北京市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，北京100026；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041）

建立用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）測定蘋果中赤霉素、脫落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑殘留量的方法。用甲醇-水溶液提取樣品中的植物生長調(diào)節(jié)劑，經(jīng)固相萃取柱凈化，用UPLC-MS/MS分析，采用多反應監(jiān)測模式，外標法定量。采用BEH Shield RP18色譜柱，以乙酸銨和乙腈為流動相，進行梯度洗脫。結論：操作簡單快捷，方法準確度和穩(wěn)定性好。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，蘋果，赤霉素，脫落酸，甲萘威，多效唑，烯效唑，檢測

Abstract：A method for the determination of gibberellin，carbaryl，abscisic acid，paclobutrazol and uniconazole in apples was established by HPLC/MS.The sample was extracted with methanol-water as extraction solvents，then cleaned up with solid-phase extraction.The analyte was determined by multi-reaction monitoring（MRM）mode was employed for the quantitative determination，and quantified by the external standard curve.The separation was performed on a UPLC BEH Shield RP18column by gradient elution with a system of wate（rcontaining 5mmol/L ammonium acetate buffer）-acetonitrile as mobile phase.Conclusion：The method is simple，accurate and suitable for the identification and quantification.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；apple；gibberellin；abscisic acid；carbaryl；paclobutrazol；uniconazole；determination

生長調(diào)節(jié)劑可分為兩大類：植物生長調(diào)節(jié)劑和昆蟲生長調(diào)節(jié)劑。目前主要使用的生長調(diào)節(jié)劑主要包括：赤霉素、多效唑、烯效唑等幾類物質。近年來，生長調(diào)節(jié)劑應用日益廣泛，我國是世界上應用生長調(diào)節(jié)劑最廣泛的國家，主要用作調(diào)節(jié)農(nóng)作物的生長發(fā)育、提高產(chǎn)量和改良品質。然而，生長調(diào)節(jié)劑與其他農(nóng)藥一樣，也有一定的毒性。特別是近年來，由于生長調(diào)節(jié)劑的濫用及使用不當導致的食品安全問題逐漸增多，引起了人們的關注，但對多種組分的檢測方法研究還很少，有的還缺乏相關檢測標準。目前

報道的關于赤霉素和（或）脫落酸的檢測方法有氣相色譜法［1］、高效液相色譜法［2-3］、液質聯(lián)用法［4］、薄層層析法［5］，多效唑、烯效唑和甲萘威的檢測方法有氣相色譜法［6］、液相色譜法［7-9］，但各類方法最多只能檢測其中的兩種物質，不能同時將這五種物質檢出，并且存在樣品前處理過程復雜、溶劑消耗多、分析時間長等問題。本文建立了同時檢測蘋果中赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑、烯效唑的超高效液相色譜及串聯(lián)質譜方法。超高效液相色譜及串聯(lián)質譜具有超高分離度、超高速度、超高靈敏度等特點，用于生長調(diào)節(jié)劑檢測研究較少，此方法的開發(fā)，可大大減少樣品分析時間。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑和烯效唑標準品 購于Dr.Ehrenstorfer公司；100!g/mL標準品儲備液 由甲醇溶解，并置于4℃冰箱中密封保存；色譜純甲醇、乙腈、乙酸銨 購于Dikma公司；實驗用水 為超純水；混標溶液 準確吸取100!L的甲萘威、多效唑、烯效唑和1mL的赤霉素、脫落酸，用甲醇定容至10mL的容量瓶中，配制成混標，含甲萘威、多效唑、烯效唑1!g/mL，赤霉素、脫落酸10!g/mL。

Waters ACQULITY UPLC超高效液相色譜儀，Waters ACQULITY TQD 質譜儀 Waters，USA；高速冷凍離心機 SIGMA，德國；均質機，氮吹儀，色譜柱（ACQULITY UPLC BEH Shield RP18 2.1×50mm，1.7!m）。

1.2 色譜分析條件

1.2.1 液相色譜操作條件 流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：10!L；流動相：A為5mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件如表1。

表1 液相梯度條件

1.2.2 質譜檢測條件 ESI-（0～2.2min），ESI+（2.2～6min），毛細管電壓2.8kV，離子橋電壓0.5V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣500L/h，錐孔氣100L/h；質譜分析條件見表2。

表2 質譜分析參數(shù)

1.3 樣品前處理

稱取樣品10g（精確至0.01g）于聚四氟乙烯離心管中，加入10mL甲醇溶液，勻漿，12000r/min離心10min，取1mL上清液氮吹至近干，用甲醇∶水 =2∶8定容至1mL，過膜，待儀器使用。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

蘋果樣品采用甲醇提取，由于赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑、烯效唑這五種化合物在甲醇中溶解度高，可以保證較好的提取效果。赤霉素溶液一般不穩(wěn)定，因此在制備樣品時應低溫振蕩提取和保存。本實驗通過氮吹的方式，進行富集濃縮，再用甲醇∶水=2∶8定容，較好地排除了基質的干擾，操作簡便快速，提高了檢測靈敏度和準確性，具備較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.2 液相色譜-質譜條件的選擇

赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑、烯效唑這五種物質極性不同，采用了梯度洗脫的方式。本實驗嘗試了含有甲酸的水溶液-乙腈、水-乙腈和含有乙酸銨的水溶液-乙腈進行比較，發(fā)現(xiàn)含有乙酸銨的水溶液-乙腈的流動相分離的效果好，峰型對稱。由于起始流動相中水相多，采用普通的C18色譜柱分離效果不好，經(jīng)過選擇比較，確定用Shield RP18柱進行分析。BEH Shield RP18色譜柱的填料是氨基甲酸酯官能團嵌入鍵合相的烷基鏈，應用了“屏蔽”鍵合相技術和亞乙基橋雜化顆粒技術，可以應用于流動相中含100%水相時使用，具備和C18相結合互補的分離選擇性和更好的峰型。

赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑、烯效唑這五種化合物性質結構各不相同，其中赤霉素和脫落酸的分子中均含有羧基，在電噴霧電離源中易產(chǎn)生［M-H］-離子，因此宜采用負離子模式。經(jīng)實驗證實，赤霉素、脫落酸在電噴霧條件下易產(chǎn)生負離子，甲萘威、多效唑、烯效唑在電噴霧條件下易產(chǎn)生正離子，因此在ESI-電離方式下，針對赤霉素、脫落酸進行了儀器的毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化選擇；在ESI+電離方式下，針對甲萘威、多效唑、烯效唑進行了儀器的毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化選擇。液相流動相采用乙腈和含有微量乙酸銨的水溶液，在梯度條件下進行分析。最后確定的梯度方法可以將赤霉素、脫落酸在2.2min內(nèi)出峰，因此在0～2.2min期間采用ESI-電離方式采集樣品，在2.2～6min采用ESI+電離方式下采集甲萘威、多效唑、烯效唑。如圖1和圖2分別為總離子流圖和多反應監(jiān)測色譜圖。

2.3 方法線性范圍、測定下限及精密度

本實驗中的標準曲線采用對五種生長調(diào)節(jié)劑的基質進行加標，最后做出加標曲線來進行定量。準確吸取一定量的混標溶液，加入到樣品中，樣品中含不同濃度梯度的標準品，其中甲萘威、多效唑、烯效唑的濃度梯度為 10、20、40、50ng/mL，赤霉素、脫落酸的濃度梯度 100、200、400、500ng/mL。經(jīng)過前處理之后，上機檢測，得到的加標曲線如圖3所示。

選用在蘋果空白樣品中添加赤霉素、脫落酸的濃度為150!g/kg，甲萘威、多效唑、烯效唑的濃度為15!g/kg，水平重復6次，以S/N≥10計的測定檢出限和標準偏差，結果見表3所示。

圖1 總離子流圖

圖2 多反應監(jiān)測色譜圖

表3 精密度實驗

圖3 甲萘威、赤霉素、烯效唑、多效唑和脫落酸的加標曲線圖

3 結論

本研究建立了液質聯(lián)用檢測蘋果中的赤霉素、脫落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑含量的方法，實驗結果表明，該方法操作簡單快捷，準確度和穩(wěn)定性好。

［1］杜黎明，許慶琴，氣相色譜法分離和測定3種植物內(nèi)源激素［J］.色譜，2000，18（1）：67-69.

［2］陳小鵬，王秀峰，孫小鐳，等.高效液相色譜法測定黃瓜瓜條中赤霉素和脫落酸含量［J］.山東農(nóng)業(yè)科學，2005（1）：65-67.

［3］謝君，張義正，植物內(nèi)源激素的反相高效液相色譜法測定［J］.分析測試學報，2001（1）：60-62.

［4］王駿，張卉，胡梅，等.液相色譜-質譜測定獼猴桃中赤霉素和脫落酸的含量［J］.食品工業(yè)，2008（4）：74-76.

［5］唐紅方，毛麗珍，鄭自強，等.薄層層析-熒光光譜法測定柑桔中赤霉素殘留量［J］.農(nóng)藥，1996（6）：32-33.

［6］陳學恒.多效唑分析方法的研究［J］.農(nóng)藥，1992，31（3）：8-10.

［7］戴蘊青，劉肅，黃衛(wèi)東，等.高效液相色譜法測定蘋果中的多效唑含量［J］.色譜，1995，13（6）：455-457.

［8］鄧海濱，王曉容，潘學文，等.烯效唑的高效液相色譜（HPLC）分析［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術學院學報，2003，16（3）：33-37.

［9］NY 660-2003.茶葉中甲蔡威、丁硫克百威、多菌靈、殘殺威和抗蚜威的最大殘留限量［S］.

Determination of gibberellin，abscisic acid，carbaryl，paclobutrazol and uniconazole in apples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHANG Hui1，WU Ying1，LU Yong2，ZHANG Wei-min2，JIANG Jie2，F(xiàn)ENG Nan2，XIE Wen-dong2
（1.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute，Beijing 100026，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China）

TS255.7

A

1002-0306（2010）10-0383-03

2010-04-08

張慧（1981-），女，助工，研究方向：分析檢測。