張寶秀，周成勇

（長(zhǎng)治學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046011）

諾氟沙星-釹金屬配合物的合成，表征及其與DNA作用的研究

張寶秀，周成勇

（長(zhǎng)治學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046011）

首次合成了稀土金屬釹與氟喹諾酮類(lèi)藥物-諾氟沙星的配合物，并應(yīng)用熒光光譜法、DNA的熱變性和黏度等方法，對(duì)該金屬配合物與小牛胸腺DNA作用方式進(jìn)行了研究。配合物與DNA作用時(shí)，熒光不發(fā)生淬滅，黏度減小；熱變性溫度基本保持不變；Scatchard圖表明配合物對(duì)溴化乙錠（EB）與DNA的結(jié)合為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明該金屬配合物與DNA作用方式為靜電結(jié)合。

諾氟沙星；釹；小牛胸腺DNA；靜電結(jié)合

氟喹諾酮類(lèi)藥物是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II（TopoisomNbase II）的抑制劑，能夠選擇性地作用于原核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶。DNA的回旋酶的兩條鏈在解開(kāi)之后，使得藥物分子鑲嵌在非配對(duì)堿基上，阻礙兩條鏈進(jìn)一步結(jié)合。諾氟沙星（Norfloxacin）是第三代喹諾酮類(lèi)的代表藥物之一[1，2]，是喹啉的衍生物，具廣譜抗菌作用，尤其對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對(duì)腸桿菌科的大部分細(xì)菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、沙門(mén)菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等在體外具良好抗菌作用。諾氟沙星體外對(duì)多重耐藥菌亦具抗菌活性。對(duì)青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星作為殺菌劑，通過(guò)作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。而金屬離子對(duì)該類(lèi)藥物在體內(nèi)的活性有重要影響，許多金屬離子可與喹諾酮分子中的3位羧基和4位酮基配位形成配合物。對(duì)喹諾酮與金屬離子配合物的合成和結(jié)構(gòu)以及性質(zhì)方面的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，并有文獻(xiàn)報(bào)道了部分配合物的抗菌活性[3-6]，但該類(lèi)配合物與DNA的作用及其抗腫瘤活性卻鮮有報(bào)道[7]。生物學(xué)只有深入到分子水平，才能從本質(zhì)上探討生命體系活動(dòng)的規(guī)律。目前，已有不少學(xué)者對(duì)氟喹諾酮與金屬離子的配位化學(xué)進(jìn)行了研究[8-16]。稀土配合物能否作為治療腫瘤的藥物是人們一直關(guān)心的問(wèn)題，曾有一些探索性的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)低劑量的稀土配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用[17]。諾氟沙星，其化學(xué)名稱(chēng)為：1-乙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉羧酸，（其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），因其抗菌譜較廣，過(guò)敏反應(yīng)少，毒副作用輕，已被廣泛應(yīng)用于臨床。因此本文合成了稀土釹離子與諾氟沙星的金屬配合物（Norf-Nd），并從分子水平研究了該金屬配合物與DNA的相互作用。文章旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)諾氟沙星的藥用價(jià)值以及探索其金屬配合物的抗腫瘤活性提供一定的理論基礎(chǔ)。這對(duì)于了解喹諾酮類(lèi)藥物在人體內(nèi)與DNA的結(jié)合方式及藥理作用等具有現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 諾氟沙星（Norfloxacin）的結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Themofinnigan Polaris質(zhì)譜儀，Perkin-Elmer 2400型元素分析儀，Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀，Shimadiu-FfIR-8300紅外儀（KBr壓片），Perkin-Elmer LS-50B型熒光光譜儀，Hewlett-Packard 8453型紫外分光光度計(jì)，BECKMANΦ50pH計(jì)，Ubbelodhe黏度計(jì)。

小牛胸腺DNA（華美生物工程公司），溶液純度以A260 nm/A280 nm>1.8衡量，濃度以260 nm處的吸光度來(lái)確定（ε=6600 L.mol-1.cm-1），于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；緩沖液由0.1 MTris溶液和0.1 M鹽酸配制（pH=7.2）；諾氟沙星（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；溴化乙啶（EB）（舒伯韋公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜

固定DNA濃度為12μM，EB濃度為5μM，然后以不同的R（cNd-Norf/cDNA）加入配合物。室溫下反應(yīng)30min，然后以激發(fā)波長(zhǎng) 520 nm，狹縫Ex=Em=10 nm，在540 nm-720 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。在作Scatchard圖時(shí)，固定DNA濃度為2.5μM，配合物濃度依次增大，室溫下反應(yīng)30 min，用100μg/mLEB溶液滴定，激發(fā)波長(zhǎng)520 nm，狹縫Ex=Em=10 nm。數(shù)據(jù)按Scatchard方程[18]處理，以r/c對(duì)r作圖（r是與DNA分子中每個(gè)核苷酸成鍵的EB分子數(shù)，c是游離EB的濃度）。

1.2.2 黏度測(cè)定

小牛胸腺DNA濃度固定為5.0×10-5M，配合物濃度依次增大，溫度恒定在（25士0.1）℃，反應(yīng)30 min，然后用烏氏黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。數(shù)據(jù)以（η/η0）1/3對(duì)配合物濃度作圖。η0代表DNA單獨(dú)存在時(shí)的黏度，η代表DNA與配合物作用后黏度。

1.2.3 熱變性研究

配制DNA-EB溶液（cDNA/cEB=20）和DNA-EB-Nd-Norf溶液（cDNA/cEB=20，cEB=cNd-Norf），用 Shimadzu循環(huán)水浴控制樣品槽的溫度從25-95℃，在波長(zhǎng)260 nm處每隔5℃測(cè)定一次樣品的紫外吸收。

1.3 配合物的合成

攪拌下，將NdCl3（0.5012 g，2.0 mmol）溶于10 mL水的溶液逐滴加入到諾氟沙星（1.277 g，4.0 mmol）溶于10 mL HCI（0.1 M）的溶液中，滴加完畢后，在反應(yīng)混合液中加入10 mL甲醇和10mLNaOH（0.1 M）溶液，在室溫下攪拌過(guò)夜，則生成白色沉淀，過(guò)濾后，固體用甲醇洗滌3次。最后再將所得固體用熱甲醇-水（1：1）做溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，真空干燥，得到配合物的白色固體。

1.4 配合物的表征

1.4.1 一般性質(zhì)分析

配合物在水中的溶解度大于諾氟沙星；配合物熔點(diǎn)＞250℃（諾氟沙星熔點(diǎn)為228℃）。測(cè)定配合物的摩爾電導(dǎo)率為 139.2 s cm2mol-1，說(shuō)明配合物是 1：2型的[19]。

1.4.2 IR圖譜分析

配合物與諾氟沙星的主要IR吸收峰對(duì)比如表1所示。

表1 配合物與諾氟沙星主要IR吸峰對(duì)比

比較二者的主要紅外吸收峰，可以發(fā)現(xiàn)在諾氟沙星配體的IR譜圖中有兩個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，即1720 cm-l（COOH）和1620 cm-l（C=O），而在配合物的IR譜中，1720 cm-l吸收峰消失，1620 cm-l處的強(qiáng)吸收峰并沒(méi)有改變。另外，配合物在1560 cm-1和1390 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)吸收峰。根據(jù)文獻(xiàn)[20]我們知道羧基負(fù)離子-COO-在1610-1550 cm-l和1400 cm-1左右可出現(xiàn)2個(gè)吸收峰和。因此我們可以判斷配體諾佛沙星和金屬Nd3+是以雙齒進(jìn)行配位，這和1720 cm-l處強(qiáng)吸收峰的消失也是一致的。另外，由于羧基負(fù)離子-COO-中兩個(gè)C-O鍵的共軛關(guān)系使得兩個(gè)C-O鍵發(fā)生平均化，新的振動(dòng)吸收峰在550 cm-l出現(xiàn)，因此我們可將其歸屬于Nd-O鍵。

1.4.3 H1NMR分析

諾氟沙星的 H1NMR中質(zhì)子的 δ 值為[21]：1.51（3H，CH3），3.61（8H，哌 嗪 CH2），4.42（2H，CH2），7.02（1H，8-H），7.30（1H，5-H），8.58（1H，2-H），和 10.08（1H，COOH）。在配合物的H1 NMR譜中，除δ10.08的吸收峰消失外，其它吸收峰的δ值變化不大（＜0.2 ppm.）。

1.4.4 元素分析和質(zhì)譜分析

元素分析：理論值（%），C，45.09；N，9.86；H，4.49。測(cè)定值（%），C，45.06；N，9.82；H，4.52。 質(zhì) 譜 分 析 MS（FAB）m/z（%）：852.37（M+，100.0）。

1.4 配合物的結(jié)構(gòu)

根據(jù)以上測(cè)定數(shù)據(jù)推斷配合物Nd-Norf的可能結(jié)構(gòu)為圖2

圖2 配合物Nd-Norf的推斷結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜研究

2.1.1 配合物對(duì)DNA-EB熒光光譜的影響

溴化乙錠（EB）為一共扼平面分子，本身熒光很弱，但能專(zhuān)一性地插入DNA雙螺旋或三螺旋內(nèi)部的堿基對(duì)之間使熒光顯著增強(qiáng)，當(dāng)配合物以插入方式與DNA結(jié)合時(shí)，EB會(huì)從DNA堿基對(duì)中被擠出，熒光發(fā)生猝滅；若為靜電結(jié)合，EB則不會(huì)被擠出，熒光不發(fā)生淬滅。因此EB可作為DNA的結(jié)構(gòu)探針[22]。由圖3可看出，在緩沖溶液中，隨著Nd-Norf配合物濃度的不斷增加，DNA-EB熒光基本不變，說(shuō)明Nd-Norf配合物與DNA是以靜電方式相互作用。

2.1.2 配合物對(duì)DNA-EB抑制作用類(lèi)型分析

利用配合物存在下DNA與EB作用的Scatchard圖可判別配合物的作用方式[23]。如圖4，在不同濃度的配合物存在下，Scatchard圖是幾條平行線(xiàn)，表明隨著配合物濃度的增大，DNA與EB的結(jié)合常數(shù)和鍵合位點(diǎn)數(shù)都沒(méi)發(fā)生改變，證明配合物與EB在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)是非竟?fàn)幮偷?，從而表明Nd-Norf配合物與DNA是以靜電方式相互作用。

圖3 EB-DNA復(fù)合物與Nd-Norf配合物作用的熒光光譜[Nd-Norf]/[DNA-EB]=0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 。

圖4 不同濃度的[Nd-Norf]存在下DNA與EB作用的Scatchard圖[DNA]=2.5μM從上到下[Nd-Norf]/[DNA]=0，0.25，0.5，1.0.

2.2 黏度研究

具有光學(xué)活性的光物理探針對(duì)于探討鍵合模式一般可提供必要但不是充分的證據(jù)[24]。在缺乏晶體數(shù)據(jù)的情況下，黏度測(cè)定一般被認(rèn)為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一[25]。

黏度對(duì)分子長(zhǎng)度變化非常敏感。當(dāng)小分子配合物以經(jīng)典插入方式與DNA相互作用時(shí)，DNA相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)增大以容納插入的配合物分子，導(dǎo)致DNA螺旋伸長(zhǎng)，相應(yīng)DNA黏度增加。DNA本身是一多聚陰離子，在溶液中，由于負(fù)電荷之間的相互靜電排斥，使DNA大分子較為伸展。而當(dāng)配合物陽(yáng)離子與DNA帶負(fù)電荷的磷酸氧基團(tuán)以靜電作用結(jié)合時(shí)，使得DNA的負(fù)電荷被部分中和，導(dǎo)致DNA螺旋收縮，分子長(zhǎng)度變小，相應(yīng)DNA黏度降低。從圖5可以看出，DNA與Nd-Norf配合物相互作用后，DNA黏度值隨配合物濃度的增加而降低，因此進(jìn)一步確定了Nd-Norf配合物是以靜電方式與DNA相互作用。

2.3 配合物與CT-DNA作用的熱變性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定DNA的熱變性溫度（tm）可以判斷配合物與DNA的作用模式。配合物與DNA發(fā)生插入作用時(shí)，將穩(wěn)定DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并使tm急劇上升；而配合物僅與DNA通過(guò)靜電作用發(fā)生外部鍵合時(shí)，則tm上升幅度較小（一般<0.6℃）或不上升[26]。如圖6所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，DNA的tm為80℃（a），而當(dāng)DNA與配合物Nd-Norf作用后，其tm仍為80℃（b），其熱變性溫度（tm）并未發(fā)生改變。這一現(xiàn)象又進(jìn)一步表明Nd-Norf配合物是通過(guò)靜電方式和DNA相互作用。

圖5 隨配合物濃度增加DNA的黏度變化圖[Nd-Norf]=0，0.5，1.0，1.5，2.0μM

圖6 DNA熱變性曲線(xiàn)圖

3 結(jié)論

綜上所述，文章合成了新的諾氟沙星-釹金屬配合物,并應(yīng)用熒光光譜法、DNA的熱變性和黏度等方法，對(duì)該金屬配合物與小牛胸腺DNA作用方式進(jìn)行了研究。配合物與DNA作用時(shí)，熒光不發(fā)生淬滅，DNA的熱變性溫度不變，黏度降低，Scatchard圖表明配合物對(duì)溴化乙錠（EB）與DNA的結(jié)合為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都一致表明，諾氟沙星-釹金屬配合物與DNA作用方式為靜電結(jié)合，即配合物通過(guò)其金屬離子所帶的正電荷與DNA磷酸骨架上磷酸基所帶的負(fù)電荷相互作用。本研究從分子水平為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)諾氟沙星的藥用價(jià)值以及探索其金屬配合物的抗腫瘤活性提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Abstract：A new Nd（Ⅲ）complex of Nd-Norf（here，Norf=Norfloxacin）have been synthesized and characterization.Its interaction with calf thymus DNA has been firstly investigated using fluorescent spectra，thermal denaturation and viscosity measurements.The experimental results show conformably that the mode of binding of the complex Nd-Norf to DNA is unclassical electrostatic action.

Keywords：DNA-binding；neodymium；Norfloxacin；calf thymus DNA

（責(zé)任編輯 王璟琳）

Synthesis，Characterization and Studieson DNA-binding of a New Nd（Ⅲ）Complex with Norfloxacin

ZHANG Bao-xiu，ZHOU Cheng-yong
（Changzhi University，Changzhi，Shanxi046011）

R914

A

1673-2014（2010）05-0008-05

2010—06—27

張寶秀（1964— ），女，山西陵川人，高級(jí)工程師，主要從事藥物化學(xué)方面的研究。