陳 瑞，高 雁

（1.忻州師范學(xué)院 ?？撇?，山西 忻州 034000；2.忻州師范學(xué)院 物理系，山西 忻州 034000）

牛血清白蛋白BSA與維生素A1的相互作用

陳 瑞1，高 雁2

（1.忻州師范學(xué)院 專科部，山西 忻州 034000；2.忻州師范學(xué)院 物理系，山西 忻州 034000）

文章通過熒光光譜技術(shù)研究了維生素A1與牛血清白蛋白BSA的相互作用。結(jié)果表明：維生素A1的加入引起了牛血清白蛋白的熒光光譜的靜態(tài)猝滅，計算了結(jié)合常數(shù)，推測了維生素A1與BSA結(jié)合的位點和驅(qū)動力。

維生素A1；牛血清白蛋白；熒光光譜

維生素A1，又稱視黃醇，是人體必需的13種維生素之一，是一種脂溶性抗氧化劑，在人體中可以維持視力，促進骨骼成長和增強抵抗力[1]。有時為了提高食品的營養(yǎng)，往往通過在食品中加入維生素進行強化。血蛋白作為體內(nèi)含量最大的蛋白，許多內(nèi)源性和外源性化合物都能與它結(jié)合，在體內(nèi)起存儲和轉(zhuǎn)運的功能，因此它在藥物代謝過程中起到了重要的作用［2］。本文對維生素A1與牛血清白蛋白（BSA）作用的光譜進行了研究。分析出維生素A1對BSA的熒光猝滅機制，由實驗得出它們的結(jié)合常數(shù)，計算出結(jié)合距離，并通過熱力學(xué)參數(shù)分析了它們之間的作用力類型。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-50B型熒光分光光度計（美國Perkin-Elmer公司），HP 8453紫外分光光度儀，循環(huán)水浴控溫比色槽，微量進樣器，牛血清白蛋白BSA（美國Sigma公司，生化試劑），維生素A1為市售產(chǎn)品。

1.2 光譜測定

利于紫外分光光度儀測定維生素A1（2.0×10-5mol·L-1）溶液的吸收光譜。

用維生素A1溶液滴定BSA溶液，以λex=290 nm，測定300～400 nm熒光光譜。測定分別在27℃和37℃下進行。

1.3 維生素A1與BSA上第一位強結(jié)合部位殘基間的距離

移取1 ml 2.0×10-5mol·L-1的BSA于1 cm石英比色池中，加入與BSA等量的維生素A1，測定其熒光光譜。在熒光分光光度計上測定BSA在290-450 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。紫外吸收光譜在300-450 nm范圍內(nèi)測定BSA與UV物（2.0×10-5mol·L-1）分子比為 1∶1 的光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 維生素A1與BSA作用的熒光光譜研究

蛋白質(zhì)的熒光光譜可以反映出蛋白分子中熒光生色基團的種類及其所處微環(huán)境及分布情況，BSA分子所具有的內(nèi)源性熒光就是由其結(jié)構(gòu)中的Trp和Tyr殘基所致。在本實驗中，當(dāng)λex=280 nm時，在345 nm附近會出現(xiàn)BSA的熒光發(fā)射峰。而維生素A1在345 nm附近區(qū)域無熒光發(fā)射峰。圖1為27℃時，維生素A1對BSA的熒光猝滅圖。由圖1可見，隨著維生素A1的加入，BSA的熒光發(fā)射峰強度逐漸降低。說明維生素A1對BSA有猝滅作用。

據(jù)文獻報道，蛋白質(zhì)的熒光猝滅有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［3］兩種機制。蛋白質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子和猝滅劑之間的相互作用引起動態(tài)猝滅，隨溫度升高其猝滅常數(shù)增大；而熒光物質(zhì)和猝滅劑發(fā)生配合反應(yīng)形成不發(fā)光的配合物引起靜態(tài)猝滅，隨溫度升高其猝滅常數(shù)減小。其中金屬配合物對蛋白質(zhì)的動態(tài)猝滅可以下式表示:

圖1 維生素A1對BSA熒光光譜的影響Fig.1 VitaMin A1 in fluences on fluorescence spectra of BSA at 27℃

圖2 維生素A1-BSA體系的Stern-Volmer方程擬合圖Fig.2 Stern-Volmer polts of VitaMin A-BSA systems

即Stern-Volmer方程，式中F0表示蛋白質(zhì)的原始熒光強度，F(xiàn)表示在加入配合物后蛋白質(zhì)的實時熒光強度，Kq為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)（L·mol-1·s-1），τ0為蛋白質(zhì)熒光平均壽命，約為 10-8s［4］。［Q］表示配合物平衡濃度，Ksv表示配合物對蛋白質(zhì)的動態(tài)猝滅常數(shù)（L·mol-1），配合物對蛋白質(zhì)的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1。研究分別在不同溫度時，以維生素A1對BSA進行滴定，由實驗數(shù)據(jù)作出BSA的Stern-Volmer曲線（圖2），按照（1）式處理實驗數(shù)據(jù)得到KSV約為3.2×1012L·mol-1·s-1，遠大于配合物對蛋白質(zhì)的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù) 2.0×1010L·mol-1·s-1。同時，猝滅常數(shù)隨溫度升高而降低，故可知維生素A1對BSA的熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅。

若維生素A1與BSA結(jié)合形成不發(fā)熒光的維生素A1-BSA復(fù)合物，同時假定每個BSA分子有n個相互獨立且完全等同的結(jié)合位點［5］，則有：

其中［P］t表示 BSA原始濃度，［P］b表示結(jié)合維生素A1后的BSA即時濃度，［P］f表示游離的BSA濃度，［S］t表示維生素A1的總濃度，F(xiàn)0和F分別表示未加和加入維生素A1的BSA熒光強度，K為維生素A1與BSA的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)。結(jié)合圖1中維生素A1對BSA的熒光猝滅數(shù)據(jù)，根據(jù)（3）式計算結(jié)合維生素A1的BSA的濃度［P］b，然后以（4）式作圖，由圖中直線的斜率可得結(jié)合常數(shù)K，見表1。

表1 維生素A1與牛血白清蛋白結(jié)合常數(shù)Table 1 Binding constants k for VitaMin A1 and BSA

2.2 維生素A1與BSA結(jié)合位點

蛋白質(zhì)中熒光基團和小分子之間的結(jié)合距離，按F?rster偶極 - 偶極無輻射能量轉(zhuǎn)移傳遞機理［6］，可由下列關(guān)系式求出：

其中，E表示能量供體和能量接受體的能量傳遞效率，R0是E為50%時臨界能量轉(zhuǎn)移距離，r表示授體-受體間距離，K表示偶極空間取向因子，K2=2/3，介質(zhì)的折射指數(shù)N=1.33，授體的熒光量子產(chǎn)率Φ=0.13，J是授體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜間的光譜重疊積分，F(xiàn)（λ）是授體在波長λ處的熒光強度，∈（λ）是受體在波長λ處的消光系數(shù)。

根據(jù)（7）式計算得 J=17M-1cm3（nm）4，代入式（6），求得 R0。由式（8）和圖3，得到維生素 A1 與BSA等摩爾比時的能量轉(zhuǎn)移效率E=0.045，然后再由式（5）可求得維生素A1與BSA中的色氨酸殘基間的距離r=3.0 nm。

圖3 BSA熒光光譜和維生素A1的UV光譜Figure.3 The UV spectra of VitaMin A1 and fluorescence spectra of BSA at20℃

2.3 作用力類型的確定

根據(jù)下列熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式，結(jié)合前面求得的不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，可計算出維生素A1與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG：

當(dāng)溫度變化區(qū)間較小時，焓變ΔH可以近似認為是一個常數(shù)。由上述熱力學(xué)公式計算出的維生素A1與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG如表2所示。

表2 維生素A1－BSA結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 ThermodynaMic parameters of VitaMin A 1-BSA binding process

配合物分子和蛋白質(zhì)等生物分子間的作用力主要有：靜電力、疏水力、范德華力和氫鍵。Ross根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力的關(guān)系，歸納出了配合物分子和蛋白質(zhì)的分子間作用力的類型。Ross認為：若ΔS＞0，ΔH≌0，配合物與蛋白之間主要以疏水作用力結(jié)合，ΔS＞0，ΔH＜0時配合物與蛋白質(zhì)分子以靜電作用力結(jié)合［7］。故推斷維生素A1與BSA的結(jié)合可能是靜電作用與疏水作用共存作用的結(jié)果。

［1］Tekes K，Gyenge M，Hantos M，Csaba G.Brain Dev，2009，31，666-670.

［2］Bakshi，MS，Jaswal，VS，Kaur，G，et al.J.Phys.Chem.C，2009，113，9121-9127.

［3］聞曉東，李萍，等.三種抗氧化物質(zhì)與牛血清白蛋白的相互作用［J］.化學(xué)學(xué)報，2007，65，421-429.

［4］楊頻，高飛.生物無機化學(xué)原理［M］.科學(xué)出版社，北京：2002，p.493.

［5］肖厚榮，盛良全，施春華，等.水楊酸與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24（1），78-81.

［6］程極濟譯：蛋白質(zhì)及核酸的激發(fā)態(tài)與能量轉(zhuǎn)移譯文集［M］.科學(xué)出版社，1981，77.

［7］Ross P D，Subramanian S.BiocheMistry，1981，20，3096-3102.

（責(zé)任編輯 王璟琳）

O657.31

A

1673-2014（2010）02-0008-03

2009—12—11

陳 瑞（1971— ），女，山西保德人，碩士，講師，主要從事基礎(chǔ)化學(xué)及實驗研究。

高 雁（1976— ），女，山西保德人，碩士，副教授，從事大學(xué)物理教學(xué)與研究工作。