譚文明 穆丹丹 儲(chǔ)小祥 丁黎

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定血漿中奧美拉唑的濃度觀察中國(guó)健康志愿者口服浙江雙偉制藥有限公司仿制的奧美拉唑腸溶膠囊(受試制劑)后的血藥濃度經(jīng)時(shí)過(guò)程，估算其相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并以阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)的奧美拉唑腸溶膠囊(洛賽克)為參比制劑，估算受試制劑的相對(duì)生物利用度，為臨床用藥提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agilent 1100液相色譜儀，含:雙高壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器(帶溫控系統(tǒng))，柱溫箱，紫外檢測(cè)器。色譜工作站:Agilent Chemstation(A.10.02)。TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));旋渦振蕩混和器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng))。

1.2 藥品和試劑 奧美拉唑?qū)φ掌酚烧憬∷幤窓z定所標(biāo)化，含量99.7%;尼美舒利對(duì)照品由浙江雙偉制藥有限公司提供，含量99.6%。奧美拉唑腸溶膠囊(浙江雙偉制藥有限公司，批號(hào)040320，20 mg/粒，受試制劑)。奧美拉唑腸溶膠囊(洛塞克)(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)0411005，20 mg/粒，參比制劑)。甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司);乙酸銨、冰乙酸、三乙胺為分析純;水為去離子純凈水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Lichrospher ODS(25 cm×4.6 mm，淮陰漢邦科技有限公司);流動(dòng)相:水(1%的冰醋酸+1%三乙胺)-甲醇 (37∶63，V/V)，流速:1.0 ml/min，柱溫:30℃，進(jìn)樣器控制溫度:5℃，檢測(cè)波長(zhǎng):302nm;進(jìn)樣量:10 l。

2.2 血漿樣品的處理 于10 ml離心管中精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(10.52 μg/ml尼美舒利甲醇溶液)50 μl，以氮?dú)饬鞔蹈桑芗尤胙獫{樣品1 ml，旋渦3秒混勻，加入6 ml乙醚，渦旋4 min，于4000 r/min離心10 min，吸取有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一10 ml玻璃離心管中，于室溫中氮?dú)饬鞔蹈?，加入流?dòng)相100μl溶解殘?jiān)?6000 r/min離心2 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品管中，進(jìn)行HPLC分析。

2.3 數(shù)據(jù)分析 將所得血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，用最小二乘法對(duì)尾段相回歸計(jì)算消除速率常數(shù)k，Cmax及Tmax均為實(shí)測(cè)值;消除半衰期(t1/2)、曲線(xiàn)下面積(AUC)分別按下列各式估算:t1/2=0.693/k，AUC0-96=∑Ci+Ci-1)·(tit})/2，AUC0-∞=AUC0-96+C96/k，其中 C96為最后取樣點(diǎn)濃度，k為末端消除速率常數(shù)。

所得參數(shù)(Tmax、Cmax、AUC0-12、AUC0-∞)用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析，其中 Cmax、AUC0-12、AUC0-∞經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后先進(jìn)行方差分析，然后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)(顯著性水平α=0.05)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 色譜行為及方法的專(zhuān)屬性 在本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLCUV條件下，奧美拉唑出峰時(shí)間在6.6 min左右，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在9.5 min左右。奧美拉唑和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中的奧美拉唑的濃度。

3.2 血漿中奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備及靈敏度 取10 ml玻璃離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)液，加入空白血漿1 ml，渦旋混勻，配成含奧美拉唑分別為3.924、9.810、29.43、98.10、196.2、490.5、981.0、1962 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)血漿，按“2.2”項(xiàng)下操作，計(jì)算奧美拉唑峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)，以f值對(duì)血藥濃度(C)作權(quán)重回歸計(jì)算，得回歸方程。不同5 d，每天做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以f值的平均值對(duì)血藥濃度(C)作回歸計(jì)算，得回歸方程:f=0.0021756×C +0.0002889(權(quán)重系數(shù) w =1/C，r=0.9998)，按上述條件測(cè)得奧美拉唑在血漿中的最低定量限為3.924 ng/ml(S/N≈10)。

3.3 回收率試驗(yàn)(絕對(duì)回收率) 取10 ml玻璃離心管數(shù)支，分別取奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)液適量于離心管中，用甲醇配成濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的奧美拉唑甲醇溶液，每份1 ml，每種濃度配制2份。加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，渦旋混勻，氮?dú)饬鞔蹈?，加入流?dòng)相100μl溶解殘?jiān)?，?6000 r/min離心2 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品管中，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值fs(fs=As/Ai)。

取10 ml玻璃離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的奧美拉唑溶液適量，精密加入1 ml空白血漿，渦旋混勻，配成含奧美拉唑 9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的血漿，每種濃度各做5份樣品。加入乙醚6 ml，渦旋4 min，于4000r/min離心10 min，精密吸取有機(jī)相4.5 ml置10 ml玻璃離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，渦旋混勻，室溫中以氮?dú)饬鞔蹈?，加入流?dòng)相100 μl溶解殘?jiān)?6000r/min離心2 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品管中，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值fx(fx=As/Ai)，將上述fx和fs的比值代入公式R%=(fx×6)/(fs×4.5)即可求得奧美拉唑的絕對(duì)回收率(R%)。高中低4 個(gè)濃度 9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奧美拉唑血漿的絕對(duì)回收率分別為82.3%、84.1%、87.8%、90.7%。

3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(相對(duì)回收率) 取10 ml玻璃離心管數(shù)支，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿，每個(gè)濃度做 5 份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，計(jì)算奧美拉唑峰面積As和峰面積Ai的比值，將該比值代入當(dāng)天隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算所得濃度與加入濃度的比值即為相對(duì)回收率，高中低4個(gè)濃度9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奧美拉唑血漿的準(zhǔn)確度分別為91.0%、94.4%、95.6%、99.1%。

3.5 精密度試驗(yàn) 取10 ml玻璃離心管數(shù)支，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿(每個(gè)濃度做5份樣品)及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按“2.2”項(xiàng)下操作。每天配制一批及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，連續(xù)做3 d，共三批，每批每個(gè)濃度做5份樣品，計(jì)算奧美拉唑峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿的批內(nèi)和批間精密度分別為11.3%和11.9%，4.4%和10.0%，2.9%和8.2%，1.2%和2.1%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取10 ml玻璃離心管數(shù)支，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制方法制備含奧美拉唑濃度分別為9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的含藥血漿，每種濃度各配制15 ml，然后精密吸取10份，每份1 ml。2份于配制好后按“2.2”項(xiàng)立即分析;2份配制好后反復(fù)凍融兩次后分析;2份于室溫放置8 h后分析;2份配制好后放入-20℃冰箱中冷凍保存6 d后取出化凍后分析;在試驗(yàn)期間上述儲(chǔ)藏條件經(jīng)反復(fù)凍融不影響血漿中奧美拉唑的含量測(cè)定。2份按血樣處理方法項(xiàng)下處理，處理后的樣品在放置0、1、6、12 h后進(jìn)樣分析，進(jìn)樣樣品在5℃自動(dòng)進(jìn)樣器中穩(wěn)定性良好。

3.7 方法質(zhì)量控制(隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及質(zhì)控樣品) 受試者血漿樣品的測(cè)定在分析方法確證完成之后進(jìn)行。在每批血漿樣品測(cè)定的同時(shí)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(即隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))及質(zhì)控樣品，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制方法見(jiàn)“3.2”項(xiàng)下，質(zhì)控樣品為含奧美拉唑濃度分別為9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每批血漿樣品的濃度數(shù)據(jù)用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得，根據(jù)高、中、低4個(gè)濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果分別為96.7%、100.6%、100.1%、99.7%，即評(píng)判該批樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)可被接受。

3.8 藥動(dòng)學(xué)研究 20名受試者分別口服參比和供試兩種制劑20 mg后的奧美拉唑平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 受試者分別口服兩種制劑20 mg后的奧美拉唑平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)

采用中國(guó)藥科大學(xué)藥代中心楊勁教授編寫(xiě)的BAPP2.0軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，奧美拉唑腸溶膠囊受試制劑和參比制劑的t1/2分別為(2.22±0.77)h和(1.96±0.48)h，達(dá)峰濃度分別為(481.6±306.7)ng/ml和(492.7±325.2)ng/ml，達(dá)峰時(shí)間分別為(2.6±1.0)h和(2.8±0.9)h。以AUC0-12計(jì)算的受試奧美拉唑腸溶膠囊的相對(duì)生物利用度(99.4±13.8)%，臨床實(shí)驗(yàn)的藥動(dòng)學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明兩種奧美拉唑膠囊生物等效。

對(duì)兩種制劑口服后的奧美拉唑參數(shù) Cmax、AUC0-τ和AUC0-∞經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，先進(jìn)行方差分析，再進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兩種制劑的上述參數(shù)生物等效，其Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明這兩種制劑生物等效。

4 討論

4.1 奧美拉唑穩(wěn)定性 奧美拉唑結(jié)構(gòu)中含有亞砜基使其穩(wěn)定性降低，對(duì)光、濕、酸等條件敏感，其在堿性條件下是穩(wěn)定的，在酸性條件下不穩(wěn)定。筆者在血漿樣品的前處理及測(cè)定過(guò)程中都注意避光，具體做法為將自動(dòng)進(jìn)樣器用黑紙遮蔽并將溫度設(shè)定在5℃。對(duì)于抽取的受試者血漿樣本及時(shí)提取，在7 d內(nèi)測(cè)定完畢。

4.2 奧美拉唑腸溶膠囊人體藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn) 奧美拉唑腸溶膠囊由一個(gè)個(gè)非常小的腸衣微顆粒組成，在小腸內(nèi)才被崩解吸收，本實(shí)驗(yàn)第0.5 h取樣點(diǎn)平均血濃僅為10ng/ml是Cmax的1/30，甚至有5名受試者血濃低于檢測(cè)限，血藥濃度吸收曲線(xiàn)體現(xiàn)了受試、參比腸溶制劑在人體消化道中正確的吸收過(guò)程。

奧美拉唑腸溶膠囊(洛賽克)說(shuō)明書(shū)指出奧美拉唑存在腸肝循環(huán)，本次實(shí)驗(yàn)中60%受試者服藥后其血藥濃度曲線(xiàn)存在“雙峰”現(xiàn)象是奧美拉唑存在腸肝循環(huán)的體現(xiàn)。

［1］丁黎，楊勁，閆花麗，等.人血漿中奧美拉唑高效液相色譜測(cè)定法及其藥代動(dòng)力學(xué)研究.藥物分析雜志，1999，19(5):300-303.

［2］付良青，黃豐，吳政德，等.中國(guó)健康志愿者的奧美拉唑及代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué).中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2003，17(1):51-54.