唐一鳴，姜中其，方蘭勇，陳 儉

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原學(xué)與免疫控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310029;2.浙江省畜牧獸醫(yī)局，浙江 杭州 310020)

恩諾沙星自1987年由德國(guó)拜爾公司研制成功并投入使用以來，已成為獸醫(yī)臨床上重要的喹諾酮類廣譜抗菌藥物。近年來，恩諾沙星的鹽類產(chǎn)品逐漸增多，常見的有鹽酸恩諾沙星、恩諾沙星鈉等，它們對(duì)大多數(shù)病原微生物均具有很好的抗菌活性，尤其是對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性菌作用很強(qiáng)。恩諾沙星乳酸鹽對(duì)胃腸道刺激小，其在獸醫(yī)臨床上尚未正式推廣應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外關(guān)于該藥的研究報(bào)道很少［1］，臨床上又迫切需要新的抗菌藥物來防治雞大腸桿菌病和沙門氏菌病。鑒此，我們以雛雞為動(dòng)物模型，開展了乳酸恩諾沙星對(duì)實(shí)驗(yàn)性雞大腸桿菌病和沙門氏菌病的藥效試驗(yàn)，旨在探索其在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用前景，并為合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物

乳酸恩諾沙星可溶性粉，由新昌國(guó)邦化學(xué)工業(yè)有限公司提供，含乳酸恩諾沙星10%，批號(hào):081001。

1.1.2 對(duì)照藥物

鹽酸環(huán)丙沙星可溶性粉，由新昌國(guó)邦化學(xué)工業(yè)有限公司提供，含鹽酸環(huán)丙沙星10%，批號(hào):090320。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡雛雞400只，從杭州市某大型雞場(chǎng)購(gòu)入，在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)3 d后供試。

1.1.4 菌種

雞源大腸桿菌C84051、雞源沙門氏菌C79-13，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.5 器材

微生物分離培養(yǎng)及鑒定器皿，鼠籠、雞舍及相關(guān)飼養(yǎng)設(shè)備等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外抑菌試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法，根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定［2］。精確稱取適量乳酸恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星，用滅菌蒸餾水分別配成一定濃度藥液，加入96孔板做2倍稀釋。分別接種雞源大腸桿菌C84051和雞源沙門氏菌C79-13于MH肉湯，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)節(jié)菌懸液濁度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，再以無(wú)菌肉湯稀釋100倍后，在含不同濃度藥物的板孔中加入100 μL。以上各步均要求無(wú)菌操作。最后，置96孔板于35℃孵育18～20 h，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度孔為 MIC(μg·mL－1);置96孔板于35℃再孵育24 h，以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度孔為 MBC(μg·mL－1)。

1.2.2 體內(nèi)藥效試驗(yàn)

從3日齡雞群中隨機(jī)抽取雛雞20只，逐羽取血進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并用抗大腸桿菌C84051和沙門氏菌C79-13標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)培養(yǎng)物作玻片凝集反應(yīng)，確認(rèn)試驗(yàn)雞群無(wú)接種菌自然感染后，再通過預(yù)試驗(yàn)確定正式試驗(yàn)感染菌的適宜接種量。取健康雞330只，隨機(jī)均分成11組。除陰性對(duì)照組外，其余各組雞每只分別經(jīng)胸肌注射大腸桿菌C84051菌液0.25 mL(培養(yǎng)液含活菌數(shù)約5×109CFU·mL－1)或沙門氏菌C79-13菌液0.35 mL(培養(yǎng)液含活菌數(shù)為20×109CFU·mL－1)，接種后各藥物治療組分別給予乳酸恩諾沙星 75，125，175 mg·L－1及對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星100 mg·L－1的飲水，連續(xù)用藥3 d，所用藥液均于當(dāng)日新鮮配制。接種及給藥后觀察和記錄各組雛雞的發(fā)病情況、臨床變化及死亡等，連續(xù)觀察7 d，剖解死亡雞，觀察病理變化并從心、肝血采樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定以確定死因，最后以雛雞的發(fā)病情況、臨床癥狀、死亡率以及增重等為指標(biāo)，評(píng)判乳酸恩諾沙星對(duì)雛雞大腸桿菌病及沙門氏菌病的療效。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌

乳酸恩諾沙星可溶性粉和對(duì)照藥物鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌C84051和沙門氏菌C79-13均產(chǎn)生明顯抑菌作用，表1結(jié)果表明，雞大腸桿菌C84051和沙門氏菌C79-13對(duì)乳酸恩諾沙星可溶性粉和對(duì)照藥物均敏感。

表1 乳酸恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)雞大腸桿菌C84051和沙門氏菌C79-13的抗菌作用

2.2 體內(nèi)藥效

2.2.1 對(duì)大腸桿菌病的療效

陽(yáng)性對(duì)照組雛雞在經(jīng)胸肌注射接種大腸桿菌C84051后約5 h開始，雞只陸續(xù)出現(xiàn)不同程度的臨床發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡，臥地沉睡或呆立反應(yīng)遲鈍，食欲減退甚至廢絕以及排白色、黃綠色稀糞等，發(fā)病率100%。各給藥組雛雞在感染當(dāng)天有輕微發(fā)病癥狀，主要是精神稍差，食欲較感染前略有下降，但給藥后2 d開始癥狀明顯改善，并很快消失。

表2可見，各給藥組雛雞的死亡率顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。剖檢死亡雞只，急性死亡雞未見明顯病變，病程較長(zhǎng)的可見滲出性纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊增厚、有滲出物等病變。分離培養(yǎng)死亡雞的心、肝血，用標(biāo)準(zhǔn)抗血清對(duì)分離菌進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明雛雞死亡是由大腸桿菌C84051感染引起敗血癥所致。接種細(xì)菌后7 d內(nèi)乳酸恩諾沙星 (75，125，175 mg·L－1)組雛雞的相對(duì)增重率顯著高于鹽酸環(huán)丙沙星 100 mg·L－1藥物對(duì)照組，另外，與陰性對(duì)照組相比，乳酸恩諾沙星(125，175 mg·L－1)組雛雞的相對(duì)增重率無(wú)顯著性差異。

2.2.2 對(duì)沙門氏菌病的療效

陽(yáng)性對(duì)照組雛雞在經(jīng)胸肌注射接種沙門氏菌C79-13后約5 h開始，雞只陸續(xù)出現(xiàn)不同程度的的臨床發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡，扎堆，呆伏不動(dòng)，縮頸閉眼，反應(yīng)遲鈍，食欲減退或廢絕，呼吸困難，排白色稀糞等，發(fā)病率100%，在接種后9 h開始死亡，死亡高峰集中在感染后24 h內(nèi)。各給藥組雛雞在感染當(dāng)天有輕微發(fā)病癥狀，主要是精神稍差，食欲較感染前略有下降，但給藥后2 d開始癥狀明顯改善，并很快消失。

表2 雛雞的死亡率和相對(duì)增重率

由表3可見，各給藥組雛雞死亡率顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。剖檢死亡雞只，急性死亡雞未見明顯病變，病程較長(zhǎng)的可見出血性肺炎，內(nèi)臟器官充血，嗉囊空虛，肝腫大脆弱，心臟壞死性結(jié)節(jié)等病理變化。分離培養(yǎng)死亡雞的心、肝血，用標(biāo)準(zhǔn)抗血清對(duì)分離菌進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)為陽(yáng)性，表明雛雞死亡是由沙門氏菌C79-13感染引起敗血癥所致。接種細(xì)菌后7 d內(nèi)乳酸恩諾沙星試驗(yàn)組雛雞的相對(duì)增重率分別顯 著 (75mg·L－1)或 極 顯 著 (125，175 mg·L－1)高于鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照組;另外，與陰性對(duì)照組相比，乳酸恩諾沙星175 mg·L－1組雛雞的相對(duì)增重率無(wú)顯著性差異。

表3 各組別雛雞的死亡率和相對(duì)增重率

3 小結(jié)及討論

大腸桿菌病和沙門氏菌病，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)最常見的細(xì)菌性疫?。?］，經(jīng)濟(jì)損失很大。近年來，雞大腸桿菌和雞沙門氏菌對(duì)抗菌藥的耐藥性逐漸增強(qiáng)［4－6］，除了合理應(yīng)用現(xiàn)有藥物［7－9］，有必要著力開發(fā)新藥來防治大腸桿菌及沙門氏菌病。

恩諾沙星是第一個(gè)動(dòng)物專用的第3代喹諾酮類藥物，其對(duì)G+和G－細(xì)菌的抗菌作用與環(huán)丙沙星相似［10］。20多年來，恩諾沙星在獸醫(yī)臨床上廣泛用于治療畜禽細(xì)菌性疾病和支原體感染，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的 MIC平均值為0.008～0.75 μg·mL－1，其藥理學(xué)特點(diǎn)已有詳盡闡述［11－12］，然而恩諾沙星在水中的溶解度極低［10］，故在生產(chǎn)實(shí)踐中其鹽類應(yīng)用更廣［1，13－14］。但迄今尚未有乳酸恩諾沙星治療雞大腸桿菌病和沙門氏菌病的報(bào)道，而乳酸鹽相對(duì)較溫和，對(duì)胃腸刺激性小［15］。本試驗(yàn)所用的恩諾沙星乳酸鹽為白色粉末，無(wú)臭，易溶于水。體內(nèi)藥效結(jié)果顯示，在較大劑量強(qiáng)毒攻擊下，乳酸恩諾沙星對(duì)受大腸桿菌及沙門氏菌感染雛雞有良好保護(hù)作用，保護(hù)率均為100%，雛雞相對(duì)增重率略低于陰性對(duì)照組，但高于藥物對(duì)照組。

綜上所述，認(rèn)為乳酸恩諾沙星能有效地控制雛雞大腸桿菌病及沙門氏菌病，迅速緩解發(fā)病癥狀，降低發(fā)病雞群的死亡率，并保持良好的增重速度，混飲的有效濃度為75～175 mg·L－1，連續(xù)用藥3 d，在臨床上應(yīng)有良好的應(yīng)用前景。

［1］曾振靈，劉建新，鄒明，等.三種恩諾沙星鹽對(duì)人工誘發(fā)雞巴氏桿菌病的療效比較［J］.中國(guó)獸藥雜志，2000，34(2):15－17.

［2］NCCLS.PerformanceStandards forAntimicrobialDisk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animal［M］.Second Ed.940 West Valley Road， Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898USA:NCCLSdocument M31-A2［ISBN 1-56238-461-9］.NCCLS，2002:21－31.

［3］Namata H，Welby S，Aerts M，et al.Identification of risk factors for the prevalence and persistence of Salmonella in Belgian broiler chicken flocks［J］. Preventive Veterinary Medicine，2009，90(3－4):211－222.

［4］郝智慧，肖希龍，邱梅，等.不同區(qū)域雞大腸桿菌對(duì)抗菌藥的耐藥性比較［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39(1):84－88.

［5］張志峰，喻華英，賈桂珍.雞沙門氏菌的分離鑒定及藥物敏感試驗(yàn)［J］.河南科學(xué)，2008，26(12):1499－1503.

［6］Ask B，van der Waaij E H，van Eck J H H，et al.Defining susceptibility of broiler chicks to colibacillosis［J］. Avian Pathology，2006，35(2):147－151.

［7］姜中其，方蘭勇，曾衛(wèi)東，等.氟羅沙星對(duì)雞實(shí)驗(yàn)性大腸桿菌病及沙門氏菌病的藥效研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24(2):211－214.

［8］李海邦.硫酸阿米卡星可溶性粉對(duì)人工誘發(fā)雞大腸桿菌和沙門氏菌的療效試驗(yàn)［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008(2):42－43.

［9］Arshad N，Neubauer C，Hasnain S，et al.Peganum harmala can minimizeEscherichia coliinfection in poultry，but long-term feeding may induce side effects［J］.Poultry Science，2008，87(2):240－249.

［10］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)［M］.2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002:237－238.

［11］Seo K H，Holt P S，Gast T K，et al.Elimination of EarlySalmonellaenteritidisInfection After Treatment with Competitive-Exclusion Culture and Enrofloxacin in Experimentally Infected Chicks［J］.Poultry Science，2000，79(10):1408－1413.

［12］de Lucas J J，Navarro J L，Rubio S，et al.Pharmacokinetic behaviour of enrofloxacin in greater rheas following a single-dose intramuscular administration［J］.Veterinary Journal，2008，175(1):136－138.

［13］劉金鳳.鹽酸恩諾沙星可溶性粉對(duì)雞大腸桿菌感染的治療試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1997，23(10)，50－51.

［14］張傳津.兩種恩諾沙星鹽對(duì)人工感染及桿菌及沙門氏菌的療效［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2003，22(4):11－13.

［15］姜中其，曾衛(wèi)東，方蘭勇.三種諾氟沙星鹽急性毒性及體外藥效的比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1997，9(6):320－322.