活潑，馮 緯，周利南，戴德慧，張艷萍，李 惠，俞遠志

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023;2.杭州市食品釀造有限公司，浙江 杭州 310021)

食用菌多糖具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成的功能，從而加強機體防御能力，促進白細胞對病毒和異常細胞吞噬功能，消除體液中自由基的產(chǎn)生，防止細胞膜質(zhì)的氧化，保護正常細胞，對病毒、細菌有良好的抑制作用等［1－2］。醬油渣是醬油生產(chǎn)的副產(chǎn)物，由于飼用價值低，大部分作為廢物被丟棄，造成資源浪費。采用微生物將其進行發(fā)酵，可生產(chǎn)具有功能性的飼料，提高其利用價值［3－4］。試驗以醬油渣為原料，采用靈芝、平菇發(fā)酵，生產(chǎn)的富含多糖的發(fā)酵物進行動物實驗，研究其對動物機體免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:平菇 P105(Pleurotus ostreatusP105)，靈芝 (Ganoderma Lucidum)。為本實驗室收藏并編號。

斜面培養(yǎng)基 (PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，醬油渣 200 g，瓊脂 20 g，水1 000 mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉1%，葡萄糖1%，麩皮粉1%，米糠1%，稻草粉1%，醬油渣30%，水100 mL，pH自然。

1.2 實驗動物

實驗用ICR小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2007－0005，清潔級，雌性，體重 (20±2)g。實驗動物使用許可證號為 SYXK(浙)2008－0106。

飼料由浙江省實驗動物中心提供，執(zhí)行標準GB 14924—2001。動物于試驗前在動物房環(huán)境中適應3 d。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵物原液的制備

500 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基250 g，滅菌消毒后，接菌種接種量 10%，置于28℃，168 r·min－1條件下培養(yǎng)4 d，菌球長滿，發(fā)酵液粘稠時，停止培養(yǎng)，80℃滅活，然后均質(zhì)，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 劑量設計

設3個劑量組和1個陰性 (蒸餾水)對照組。以靈芝發(fā)酵液原液含1 g·100 mL－1靈芝多糖計，低、中、高 3個 劑 量 分 別 為 50、100、200 mg·kg－1靈芝多糖。50、100 mg·kg－1靈芝多糖劑量組分別稱取原液25、50 g加蒸餾水至100 mL，配制成濃度為 2.5和 5mg·mL－1樣品，200 mg·kg－1靈芝多糖直接用原液，灌胃給樣品，灌胃容量按 0.02 mL·g－1計。

1.4 檢測項目

1.4.1 足跖增厚 (DTH)和血清溶血素 (血凝法)

各組灌胃給受試物，每天1次，連續(xù)30 d。

在25 d，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2% (V/V)壓積綿羊紅細胞 (SRBC)懸液，進行免疫。

免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20% (V/V)SRBC，每只鼠20 μL(約1×108個 SRBC)，注射后24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。

免疫后5 d，取血離心，收集血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

1.4.2 碳廓清吞噬指數(shù)和胸腺/體重及脾臟/體重值

各組灌胃給受試物，每天1次，連續(xù)30 d。

在30 d，每鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3～4倍的印度墨汁，按 0.01 mL·g－1計算，墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血 20 μL，并將其加到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用721分光光度計在600 nm波長處測光密度值，以Na2CO3溶液作空白對照。第2次采血結束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。計算吞噬指數(shù)。

在30 d，處死動物，取其胸腺及脾臟，稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重值。

檢測環(huán)境條件，溫度20～24℃，相對濕度40%～70%。數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠足跖增厚

注射發(fā)酵物的小鼠經(jīng)綿羊紅細胞誘導足跖增厚結果見表1。3個劑量組小鼠左后足跖部24 h與0 h厚度測量差值分別與陰性對照組 (蒸餾水)比較均有明顯增加，差異均有顯著性 (P＜0.05)。

2.2 小鼠血清溶血素

注射發(fā)酵物的小鼠經(jīng)綿羊紅細胞誘導血清溶血素結果見表1。高劑量組小鼠血清溶血素抗體積數(shù)值與陰性對照組 (蒸餾水)比較有明顯增高，差異有顯著性。

表1 靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物對小鼠足跖增厚和血清溶血素的影響

2.3 小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)和臟器/體重值

試驗結果見表2。3個劑量組小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)和胸腺/體重及脾臟/體重的值與陰性對照組 (蒸餾水)比較差異均無顯著性。

表2 靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物對小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)和臟器/體重值的影響

2.4 小鼠體重

表3為綿羊紅細胞誘導小鼠足跖增厚、血清溶血素2項試驗體重，表4為小鼠碳廓清試驗和臟器/體重值測定2項試驗小鼠體重。3個劑量組小鼠體重在試驗的初期、中期及終期和陰性對照組(蒸餾水)比較，差異均無顯著性。

表3 靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物對小鼠體重的影響

表4 靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物對小鼠體重的影響

3 小結和討論

靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物3個劑量組小鼠左后足跖部24 h與0 h厚度測量差值分別與陰性對照組 (蒸餾水)比較差異均有顯著性;高劑量組小鼠血清溶血素抗體積數(shù)值與陰性對照組 (蒸餾水)比較差異也有顯著性，表明本試驗條件下靈芝、平菇醬油渣發(fā)酵物有一定的增強細胞免疫功能和體液免疫功能的作用。

［1］方晶，李從強，柯麗霞，等.食用菌多糖的研究［J］.微生物學雜志，2008(2):4－7.

［2］江振友，林晨.靈芝多糖對小鼠細胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的實驗研究［J］.微生物學雜志，2003，23(2):51－54.

［3］邱宏端，李明偉，陳聰輝，等.耐鹽紅螺菌科細菌發(fā)酵醬渣生產(chǎn)蛋白飼料的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2002，18(6):118－121.

［4］閻杰.釀造醬渣開發(fā)利用的研究進展［J］.中國釀造，2007，167(2):5－8.