錢(qián)麗華，阮松林，戴丹麗，忻 雅

(1.浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

三葉青是葡萄科多年生蔓生藤本植物，分布于浙江、江西、福建等10多個(gè)省 (區(qū))，醫(yī)學(xué)臨床試驗(yàn)表明具有清熱解毒、消腫散結(jié)、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效，可用于治療小兒高熱、扁桃體炎、肝炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，也是抗腫瘤常用藥物，而且對(duì)肝癌和血癌細(xì)胞具有“促凋亡作用”。國(guó)內(nèi)關(guān)于三葉青藥理、抗病機(jī)制方面的研究很多，但有關(guān)三葉青生理方面的研究罕見(jiàn)報(bào)道。三葉青對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻、生長(zhǎng)速度極其緩慢，野生資源稀少，因人為狂采濫挖，已瀕臨滅絕，為了保護(hù)三葉青野生資源，提高其人工馴化栽培水平，實(shí)現(xiàn)三葉青產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，特開(kāi)展高溫、低溫等不同溫度梯度處理對(duì)三葉青試管組培苗生長(zhǎng)影響的研究，篩選出三葉青試管組培苗最適生長(zhǎng)溫度，探究組培苗抗高溫和低溫逆境能力，以期為三葉青田間馴化栽培管理提供技術(shù)參考依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

以三葉青3 cm左右的不定芽為供試材料。將三葉青不定芽接種于繼代培養(yǎng)基上，每瓶接種大小一致的不定芽5株，光照培養(yǎng)8 d，不定芽基部愈傷組織膨大，然后在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫和低溫處理，每個(gè)處理3瓶，處理前稱(chēng)量不定芽原始鮮重，高溫處理為30℃，35℃，40℃，45℃ 4個(gè)溫度，低溫處理為10℃和5℃ 2個(gè)溫度，對(duì)照為25℃，高溫處理時(shí)間為16 h，低溫處理時(shí)間為24 h，處理后將其轉(zhuǎn)入對(duì)照溫度下繼續(xù)培養(yǎng)，1個(gè)月后取出稱(chēng)量各處理不定芽鮮重，同時(shí)測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白等生理指標(biāo)。

SOD活性測(cè)定。取1 g試管組培苗不定芽材料，加入預(yù)冷2 mL 25 mmol，pH值7.8的磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆谩?50 μL上清液和 3 mL NBT反應(yīng)液 (含50 mmol磷酸緩沖液、13 mmol甲硫氨酸、63 μmol NBT、1.3 mol核黃素和0.1 mol EDTA)，放入10 mL試管中，在25℃下光照30 min?？瞻滓? mL NBT反應(yīng)液 +50 μL的緩沖液作本底，用緩沖液調(diào)零。以抑制NBT光化還原為1個(gè)酶活力單位。

MDA含量測(cè)定。取1 g試管組培苗不定芽材料，加入預(yù)冷3 mL 50 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心 20 min，取上清液轉(zhuǎn)入 1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆?。? mL上清液和3 mL TCA反應(yīng)液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL試管中，在95℃水浴中保溫30 min，然后立即置于冰浴中冷卻，在4℃下12 500 r·min－1離心10 min，在532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，按經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算獲得MDA含量。

可溶性蛋白含量測(cè)定。取0.5 g試管組培苗不定芽材料，加入預(yù)冷2 mL 25 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆?。?0 μL上清液和3 mL考馬斯亮蘭 G-250溶液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL試管中，在室溫下反應(yīng)15 min，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。以牛血清 (BSA)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，計(jì)算可溶性蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)鮮重的影響

測(cè)定結(jié)果 (圖1)表明，在高溫處理中，30℃、35℃處理后三葉青試管組培苗鮮重增加最明顯，平均鮮重增加達(dá)到4.402 7～5.149 3 g，兩者之間不存在顯著差異，但均極顯著優(yōu)于其它4個(gè)處理。在25～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，三葉青試管植株鮮重呈遞增趨勢(shì)，但當(dāng)溫度升至40℃，三葉青試管植株鮮重增加明顯減少，且低于其它5個(gè)處理，當(dāng)溫度升至45℃時(shí)，三葉青試管植株全部黃化死亡。低溫處理，隨著溫度的下降，三葉青試管植株鮮重增加逐漸減少，但兩者之間不存在顯著差異，與對(duì)照之間也不存在顯著差異，這有待于進(jìn)一步分析。因此，我們認(rèn)為30～35℃是三葉青試管組培苗生長(zhǎng)的最適宜溫度，而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長(zhǎng)。

圖1 不同溫度處理后三葉青試管組培苗鮮重變化

2.2 對(duì)SOD酶活性的影響

25～35℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，三葉青試管組培苗SOD酶活性逐漸上升，在35℃時(shí)達(dá)到最高 (圖2)，當(dāng)溫度上升至40℃時(shí)，SOD酶活性快速下降至最低;低溫5℃或10℃處理后，三葉青試管組培苗SOD酶活性均低于對(duì)照，兩者之間不存在顯著差異。由此可見(jiàn)，35℃時(shí)SOD酶活性最高，而40℃時(shí)SOD酶活性則最低。

圖2 溫度處理三葉青組培苗SOD酶活性的變化

2.3 對(duì)MDA含量的影響

從圖3看出，25～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，MDA呈下降趨勢(shì)，35℃時(shí)三葉青試管組培苗的MDA含量降至最低，當(dāng)溫度升至40℃，三葉青試管組培苗中MDA含量大幅增加，明顯高于其它各處理，30℃處理后三葉青試管組培苗中MDA含量與對(duì)照基本一致;低溫處理中，5℃下三葉青組培苗中MDA含量高于對(duì)照，而10℃下MDA含量低于對(duì)照，這有待于進(jìn)一步分析。由此可見(jiàn)，40℃下 MDA含量最高，其次為5℃，而35℃時(shí)MDA含量則最低。

圖3 溫度處理三葉青組培苗MDA含量的變化

2.4 對(duì)可溶性蛋白含量的影響

25～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度上升，可溶性蛋白含量也隨之升高，且以35℃時(shí)可溶性蛋白含量最高，當(dāng)溫度升至40℃時(shí)，可溶性蛋白明顯下降(圖4);5℃，10℃低溫處理后三葉青試管組培苗可溶性蛋白含量均高于對(duì)照。由此可見(jiàn)35℃及10℃以下都引起植株可溶性蛋白含量的增加，而40℃以上則引起可溶性蛋白含量的下降。

圖4 溫度處理三葉青組培苗可溶性蛋白含量的變化

3 小結(jié)與討論

30～35℃是三葉青試管組培苗生長(zhǎng)的最適宜溫度，平均鮮重增加達(dá)到4.402 7～5.149 3 g;而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)緩慢，鮮重變化小。

SOD酶含量隨溫度上升而上升，在35℃時(shí)達(dá)到最高，這主要是由于在溫度脅迫下，植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的防御體系對(duì)溫度脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng)［1］，導(dǎo)致SOD酶活性上升，而40℃以上或10℃以下溫度處理后SOD酶含量明顯較其它處理低，這可能是由于此時(shí)溫度脅迫已經(jīng)超過(guò)了三葉青機(jī)體的耐受能力，無(wú)法清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧，SOD酶活性下降，膜修復(fù)能力減弱，植株生長(zhǎng)緩慢。

MDA是膜系統(tǒng)受害的一個(gè)重要標(biāo)志之一［2］。5℃和40℃處理后MDA含量明顯較其它處理高，這可能是由于高低溫逆境下，三葉青試管苗細(xì)胞膜脂發(fā)生了過(guò)氧化，產(chǎn)生了植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA，從而對(duì)膜造成嚴(yán)重傷害。

一般認(rèn)為可溶性蛋白含量與植物的抗冷性之間存在密切關(guān)系。在逆境脅迫條件下，植物可溶性蛋白含量會(huì)增加，由于它的親水膠體性質(zhì)強(qiáng)，能增加細(xì)胞持水性，因此可減少原生質(zhì)因結(jié)冰而傷害致死的可能性［3］。試驗(yàn)中5～10℃低溫脅迫可能誘導(dǎo)了低溫相關(guān)蛋白表達(dá)，植株產(chǎn)生抗冷應(yīng)急反應(yīng)，引起可溶性蛋白含量明顯增加;35℃溫度時(shí)可溶性蛋白含量最高，這可能與三葉青生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的增加有關(guān);40℃溫度抑制了三葉青試管組培苗生長(zhǎng)，可溶性蛋白含量有所下降，可能與高溫脅迫下蛋白質(zhì)合成受阻或發(fā)生降解有關(guān)，楊華庚等［4］對(duì)蝴蝶蘭幼苗進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下蛋白質(zhì)含量在下降，推測(cè)與蛋白質(zhì)合成受阻或降解有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，三葉青栽培中生長(zhǎng)溫度為30～35℃時(shí)，有利于幼苗地上部生長(zhǎng);當(dāng)溫度降至10℃以下或升至40℃以上時(shí)，則需考慮做好保溫或降溫措施。

［1］羅婭，湯浩茹，張勇.低溫脅迫對(duì)草莓葉片 SOD和 ASAGSH循環(huán)酶系統(tǒng)的影響［J］.園藝學(xué)報(bào)，2007，34(6):1405－1410.

［2］陳少裕.膜脂過(guò)氧化對(duì)植物細(xì)胞的傷害［J］.植物生理學(xué)通訊，1991，27(2):84－90.

［3］江福英，李延，翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，17(3):190－195.

［4］楊華庚，陳慧娟.高溫脅迫對(duì)蝴蝶蘭幼苗葉片形態(tài)和生理特性的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(1):123－127.