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        溫度對(duì)三葉青組培苗SOD、MDA等指標(biāo)的影響

        2010-09-12 01:16:16錢(qián)麗華阮松林戴丹麗
        浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年5期
        關(guān)鍵詞:培苗離心管試管

        錢(qián)麗華,阮松林,戴丹麗,忻 雅

        (1.浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

        三葉青是葡萄科多年生蔓生藤本植物,分布于浙江、江西、福建等10多個(gè)省 (區(qū)),醫(yī)學(xué)臨床試驗(yàn)表明具有清熱解毒、消腫散結(jié)、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效,可用于治療小兒高熱、扁桃體炎、肝炎及病毒性腦膜炎等多種疾病,也是抗腫瘤常用藥物,而且對(duì)肝癌和血癌細(xì)胞具有“促凋亡作用”。國(guó)內(nèi)關(guān)于三葉青藥理、抗病機(jī)制方面的研究很多,但有關(guān)三葉青生理方面的研究罕見(jiàn)報(bào)道。三葉青對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻、生長(zhǎng)速度極其緩慢,野生資源稀少,因人為狂采濫挖,已瀕臨滅絕,為了保護(hù)三葉青野生資源,提高其人工馴化栽培水平,實(shí)現(xiàn)三葉青產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,特開(kāi)展高溫、低溫等不同溫度梯度處理對(duì)三葉青試管組培苗生長(zhǎng)影響的研究,篩選出三葉青試管組培苗最適生長(zhǎng)溫度,探究組培苗抗高溫和低溫逆境能力,以期為三葉青田間馴化栽培管理提供技術(shù)參考依據(jù)和指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        以三葉青3 cm左右的不定芽為供試材料。將三葉青不定芽接種于繼代培養(yǎng)基上,每瓶接種大小一致的不定芽5株,光照培養(yǎng)8 d,不定芽基部愈傷組織膨大,然后在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫和低溫處理,每個(gè)處理3瓶,處理前稱(chēng)量不定芽原始鮮重,高溫處理為30℃,35℃,40℃,45℃ 4個(gè)溫度,低溫處理為10℃和5℃ 2個(gè)溫度,對(duì)照為25℃,高溫處理時(shí)間為16 h,低溫處理時(shí)間為24 h,處理后將其轉(zhuǎn)入對(duì)照溫度下繼續(xù)培養(yǎng),1個(gè)月后取出稱(chēng)量各處理不定芽鮮重,同時(shí)測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白等生理指標(biāo)。

        SOD活性測(cè)定。取1 g試管組培苗不定芽材料,加入預(yù)冷2 mL 25 mmol,pH值7.8的磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L-1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末,在冰浴中研磨成勻漿,倒入1.5 mL離心管中,于4℃下12 500 r·min-1離心20 min,取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,置于4℃?zhèn)溆谩?50 μL上清液和 3 mL NBT反應(yīng)液 (含50 mmol磷酸緩沖液、13 mmol甲硫氨酸、63 μmol NBT、1.3 mol核黃素和0.1 mol EDTA),放入10 mL試管中,在25℃下光照30 min??瞻滓? mL NBT反應(yīng)液 +50 μL的緩沖液作本底,用緩沖液調(diào)零。以抑制NBT光化還原為1個(gè)酶活力單位。

        MDA含量測(cè)定。取1 g試管組培苗不定芽材料,加入預(yù)冷3 mL 50 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含2%PVP)和少量石英砂粉末,在冰浴中研磨成勻漿,倒入1.5 mL離心管中,于4℃下12 500 r·min-1離心 20 min,取上清液轉(zhuǎn)入 1.5 mL離心管中,置于4℃?zhèn)溆?。? mL上清液和3 mL TCA反應(yīng)液 (0.6%TBA和20%TCA),放入10 mL試管中,在95℃水浴中保溫30 min,然后立即置于冰浴中冷卻,在4℃下12 500 r·min-1離心10 min,在532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度,按經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算獲得MDA含量。

        可溶性蛋白含量測(cè)定。取0.5 g試管組培苗不定芽材料,加入預(yù)冷2 mL 25 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L-1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末,在冰浴中研磨成勻漿,倒入1.5 mL離心管中,于4℃下12 500 r·min-1離心20 min,取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,置于4℃?zhèn)溆?。?0 μL上清液和3 mL考馬斯亮蘭 G-250溶液 (0.6%TBA和20%TCA),放入10 mL試管中,在室溫下反應(yīng)15 min,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。以牛血清 (BSA)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,計(jì)算可溶性蛋白含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 對(duì)鮮重的影響

        測(cè)定結(jié)果 (圖1)表明,在高溫處理中,30℃、35℃處理后三葉青試管組培苗鮮重增加最明顯,平均鮮重增加達(dá)到4.402 7~5.149 3 g,兩者之間不存在顯著差異,但均極顯著優(yōu)于其它4個(gè)處理。在25~35℃范圍內(nèi),隨著溫度的上升,三葉青試管植株鮮重呈遞增趨勢(shì),但當(dāng)溫度升至40℃,三葉青試管植株鮮重增加明顯減少,且低于其它5個(gè)處理,當(dāng)溫度升至45℃時(shí),三葉青試管植株全部黃化死亡。低溫處理,隨著溫度的下降,三葉青試管植株鮮重增加逐漸減少,但兩者之間不存在顯著差異,與對(duì)照之間也不存在顯著差異,這有待于進(jìn)一步分析。因此,我們認(rèn)為30~35℃是三葉青試管組培苗生長(zhǎng)的最適宜溫度,而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長(zhǎng)。

        圖1 不同溫度處理后三葉青試管組培苗鮮重變化

        2.2 對(duì)SOD酶活性的影響

        25~35℃溫度范圍內(nèi),隨著溫度的上升,三葉青試管組培苗SOD酶活性逐漸上升,在35℃時(shí)達(dá)到最高 (圖2),當(dāng)溫度上升至40℃時(shí),SOD酶活性快速下降至最低;低溫5℃或10℃處理后,三葉青試管組培苗SOD酶活性均低于對(duì)照,兩者之間不存在顯著差異。由此可見(jiàn),35℃時(shí)SOD酶活性最高,而40℃時(shí)SOD酶活性則最低。

        圖2 溫度處理三葉青組培苗SOD酶活性的變化

        2.3 對(duì)MDA含量的影響

        從圖3看出,25~35℃范圍內(nèi),隨著溫度的上升,MDA呈下降趨勢(shì),35℃時(shí)三葉青試管組培苗的MDA含量降至最低,當(dāng)溫度升至40℃,三葉青試管組培苗中MDA含量大幅增加,明顯高于其它各處理,30℃處理后三葉青試管組培苗中MDA含量與對(duì)照基本一致;低溫處理中,5℃下三葉青組培苗中MDA含量高于對(duì)照,而10℃下MDA含量低于對(duì)照,這有待于進(jìn)一步分析。由此可見(jiàn),40℃下 MDA含量最高,其次為5℃,而35℃時(shí)MDA含量則最低。

        圖3 溫度處理三葉青組培苗MDA含量的變化

        2.4 對(duì)可溶性蛋白含量的影響

        25~35℃范圍內(nèi),隨著溫度上升,可溶性蛋白含量也隨之升高,且以35℃時(shí)可溶性蛋白含量最高,當(dāng)溫度升至40℃時(shí),可溶性蛋白明顯下降(圖4);5℃,10℃低溫處理后三葉青試管組培苗可溶性蛋白含量均高于對(duì)照。由此可見(jiàn)35℃及10℃以下都引起植株可溶性蛋白含量的增加,而40℃以上則引起可溶性蛋白含量的下降。

        圖4 溫度處理三葉青組培苗可溶性蛋白含量的變化

        3 小結(jié)與討論

        30~35℃是三葉青試管組培苗生長(zhǎng)的最適宜溫度,平均鮮重增加達(dá)到4.402 7~5.149 3 g;而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長(zhǎng),植株生長(zhǎng)緩慢,鮮重變化小。

        SOD酶含量隨溫度上升而上升,在35℃時(shí)達(dá)到最高,這主要是由于在溫度脅迫下,植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的防御體系對(duì)溫度脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng)[1],導(dǎo)致SOD酶活性上升,而40℃以上或10℃以下溫度處理后SOD酶含量明顯較其它處理低,這可能是由于此時(shí)溫度脅迫已經(jīng)超過(guò)了三葉青機(jī)體的耐受能力,無(wú)法清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧,SOD酶活性下降,膜修復(fù)能力減弱,植株生長(zhǎng)緩慢。

        MDA是膜系統(tǒng)受害的一個(gè)重要標(biāo)志之一[2]。5℃和40℃處理后MDA含量明顯較其它處理高,這可能是由于高低溫逆境下,三葉青試管苗細(xì)胞膜脂發(fā)生了過(guò)氧化,產(chǎn)生了植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA,從而對(duì)膜造成嚴(yán)重傷害。

        一般認(rèn)為可溶性蛋白含量與植物的抗冷性之間存在密切關(guān)系。在逆境脅迫條件下,植物可溶性蛋白含量會(huì)增加,由于它的親水膠體性質(zhì)強(qiáng),能增加細(xì)胞持水性,因此可減少原生質(zhì)因結(jié)冰而傷害致死的可能性[3]。試驗(yàn)中5~10℃低溫脅迫可能誘導(dǎo)了低溫相關(guān)蛋白表達(dá),植株產(chǎn)生抗冷應(yīng)急反應(yīng),引起可溶性蛋白含量明顯增加;35℃溫度時(shí)可溶性蛋白含量最高,這可能與三葉青生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的增加有關(guān);40℃溫度抑制了三葉青試管組培苗生長(zhǎng),可溶性蛋白含量有所下降,可能與高溫脅迫下蛋白質(zhì)合成受阻或發(fā)生降解有關(guān),楊華庚等[4]對(duì)蝴蝶蘭幼苗進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下蛋白質(zhì)含量在下降,推測(cè)與蛋白質(zhì)合成受阻或降解有關(guān)。

        試驗(yàn)結(jié)果表明,三葉青栽培中生長(zhǎng)溫度為30~35℃時(shí),有利于幼苗地上部生長(zhǎng);當(dāng)溫度降至10℃以下或升至40℃以上時(shí),則需考慮做好保溫或降溫措施。

        [1]羅婭,湯浩茹,張勇.低溫脅迫對(duì)草莓葉片 SOD和 ASAGSH循環(huán)酶系統(tǒng)的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2007,34(6):1405-1410.

        [2]陳少裕.膜脂過(guò)氧化對(duì)植物細(xì)胞的傷害[J].植物生理學(xué)通訊,1991,27(2):84-90.

        [3]江福英,李延,翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,17(3):190-195.

        [4]楊華庚,陳慧娟.高溫脅迫對(duì)蝴蝶蘭幼苗葉片形態(tài)和生理特性的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(1):123-127.

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