錢麗華，阮松林，戴丹麗，忻 雅

(1.浙江省杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024;2.浙江省農業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

三葉青是葡萄科多年生蔓生藤本植物，分布于浙江、江西、福建等10多個省 (區(qū))，醫(yī)學臨床試驗表明具有清熱解毒、消腫散結、祛風化痰、活血止痛的功效，可用于治療小兒高熱、扁桃體炎、肝炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，也是抗腫瘤常用藥物，而且對肝癌和血癌細胞具有“促凋亡作用”。國內關于三葉青藥理、抗病機制方面的研究很多，但有關三葉青生理方面的研究罕見報道。三葉青對生長環(huán)境要求苛刻、生長速度極其緩慢，野生資源稀少，因人為狂采濫挖，已瀕臨滅絕，為了保護三葉青野生資源，提高其人工馴化栽培水平，實現三葉青產業(yè)化發(fā)展，特開展高溫、低溫等不同溫度梯度處理對三葉青試管組培苗生長影響的研究，篩選出三葉青試管組培苗最適生長溫度，探究組培苗抗高溫和低溫逆境能力，以期為三葉青田間馴化栽培管理提供技術參考依據和指導。

1 材料與方法

以三葉青3 cm左右的不定芽為供試材料。將三葉青不定芽接種于繼代培養(yǎng)基上，每瓶接種大小一致的不定芽5株，光照培養(yǎng)8 d，不定芽基部愈傷組織膨大，然后在光照培養(yǎng)箱中進行高溫和低溫處理，每個處理3瓶，處理前稱量不定芽原始鮮重，高溫處理為30℃，35℃，40℃，45℃ 4個溫度，低溫處理為10℃和5℃ 2個溫度，對照為25℃，高溫處理時間為16 h，低溫處理時間為24 h，處理后將其轉入對照溫度下繼續(xù)培養(yǎng)，1個月后取出稱量各處理不定芽鮮重，同時測定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白等生理指標。

SOD活性測定。取1 g試管組培苗不定芽材料，加入預冷2 mL 25 mmol，pH值7.8的磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心20 min，取上清液轉入1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆?。?50 μL上清液和 3 mL NBT反應液 (含50 mmol磷酸緩沖液、13 mmol甲硫氨酸、63 μmol NBT、1.3 mol核黃素和0.1 mol EDTA)，放入10 mL試管中，在25℃下光照30 min?？瞻滓? mL NBT反應液 +50 μL的緩沖液作本底，用緩沖液調零。以抑制NBT光化還原為1個酶活力單位。

MDA含量測定。取1 g試管組培苗不定芽材料，加入預冷3 mL 50 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心 20 min，取上清液轉入 1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆?。? mL上清液和3 mL TCA反應液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL試管中，在95℃水浴中保溫30 min，然后立即置于冰浴中冷卻，在4℃下12 500 r·min－1離心10 min，在532和600 nm波長下測定光密度，按經驗公式計算獲得MDA含量。

可溶性蛋白含量測定。取0.5 g試管組培苗不定芽材料，加入預冷2 mL 25 mmol、pH值7.8磷酸緩沖液 (含0.2 mmol EDTA、2 mol·L－1抗壞血酸和2%PVP)和少量石英砂粉末，在冰浴中研磨成勻漿，倒入1.5 mL離心管中，于4℃下12 500 r·min－1離心20 min，取上清液轉入1.5 mL離心管中，置于4℃?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL上清液和3 mL考馬斯亮蘭 G-250溶液 (0.6%TBA和20%TCA)，放入10 mL試管中，在室溫下反應15 min，在595 nm波長下測定光密度。以牛血清 (BSA)為標準對照，計算可溶性蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 對鮮重的影響

測定結果 (圖1)表明，在高溫處理中，30℃、35℃處理后三葉青試管組培苗鮮重增加最明顯，平均鮮重增加達到4.402 7～5.149 3 g，兩者之間不存在顯著差異，但均極顯著優(yōu)于其它4個處理。在25～35℃范圍內，隨著溫度的上升，三葉青試管植株鮮重呈遞增趨勢，但當溫度升至40℃，三葉青試管植株鮮重增加明顯減少，且低于其它5個處理，當溫度升至45℃時，三葉青試管植株全部黃化死亡。低溫處理，隨著溫度的下降，三葉青試管植株鮮重增加逐漸減少，但兩者之間不存在顯著差異，與對照之間也不存在顯著差異，這有待于進一步分析。因此，我們認為30～35℃是三葉青試管組培苗生長的最適宜溫度，而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長。

圖1 不同溫度處理后三葉青試管組培苗鮮重變化

2.2 對SOD酶活性的影響

25～35℃溫度范圍內，隨著溫度的上升，三葉青試管組培苗SOD酶活性逐漸上升，在35℃時達到最高 (圖2)，當溫度上升至40℃時，SOD酶活性快速下降至最低;低溫5℃或10℃處理后，三葉青試管組培苗SOD酶活性均低于對照，兩者之間不存在顯著差異。由此可見，35℃時SOD酶活性最高，而40℃時SOD酶活性則最低。

圖2 溫度處理三葉青組培苗SOD酶活性的變化

2.3 對MDA含量的影響

從圖3看出，25～35℃范圍內，隨著溫度的上升，MDA呈下降趨勢，35℃時三葉青試管組培苗的MDA含量降至最低，當溫度升至40℃，三葉青試管組培苗中MDA含量大幅增加，明顯高于其它各處理，30℃處理后三葉青試管組培苗中MDA含量與對照基本一致;低溫處理中，5℃下三葉青組培苗中MDA含量高于對照，而10℃下MDA含量低于對照，這有待于進一步分析。由此可見，40℃下 MDA含量最高，其次為5℃，而35℃時MDA含量則最低。

圖3 溫度處理三葉青組培苗MDA含量的變化

2.4 對可溶性蛋白含量的影響

25～35℃范圍內，隨著溫度上升，可溶性蛋白含量也隨之升高，且以35℃時可溶性蛋白含量最高，當溫度升至40℃時，可溶性蛋白明顯下降(圖4);5℃，10℃低溫處理后三葉青試管組培苗可溶性蛋白含量均高于對照。由此可見35℃及10℃以下都引起植株可溶性蛋白含量的增加，而40℃以上則引起可溶性蛋白含量的下降。

圖4 溫度處理三葉青組培苗可溶性蛋白含量的變化

3 小結與討論

30～35℃是三葉青試管組培苗生長的最適宜溫度，平均鮮重增加達到4.402 7～5.149 3 g;而40℃以上或10℃以下溫度則不利于三葉青試管組培苗生長，植株生長緩慢，鮮重變化小。

SOD酶含量隨溫度上升而上升，在35℃時達到最高，這主要是由于在溫度脅迫下，植物會通過調節(jié)自身的防御體系對溫度脅迫作出適應性反應［1］，導致SOD酶活性上升，而40℃以上或10℃以下溫度處理后SOD酶含量明顯較其它處理低，這可能是由于此時溫度脅迫已經超過了三葉青機體的耐受能力，無法清除體內過多的活性氧，SOD酶活性下降，膜修復能力減弱，植株生長緩慢。

MDA是膜系統受害的一個重要標志之一［2］。5℃和40℃處理后MDA含量明顯較其它處理高，這可能是由于高低溫逆境下，三葉青試管苗細胞膜脂發(fā)生了過氧化，產生了植物細胞膜脂過氧化的產物MDA，從而對膜造成嚴重傷害。

一般認為可溶性蛋白含量與植物的抗冷性之間存在密切關系。在逆境脅迫條件下，植物可溶性蛋白含量會增加，由于它的親水膠體性質強，能增加細胞持水性，因此可減少原生質因結冰而傷害致死的可能性［3］。試驗中5～10℃低溫脅迫可能誘導了低溫相關蛋白表達，植株產生抗冷應急反應，引起可溶性蛋白含量明顯增加;35℃溫度時可溶性蛋白含量最高，這可能與三葉青生長相關蛋白的增加有關;40℃溫度抑制了三葉青試管組培苗生長，可溶性蛋白含量有所下降，可能與高溫脅迫下蛋白質合成受阻或發(fā)生降解有關，楊華庚等［4］對蝴蝶蘭幼苗進行高溫脅迫試驗中，也發(fā)現高溫脅迫下蛋白質含量在下降，推測與蛋白質合成受阻或降解有關。

試驗結果表明，三葉青栽培中生長溫度為30～35℃時，有利于幼苗地上部生長;當溫度降至10℃以下或升至40℃以上時，則需考慮做好保溫或降溫措施。

［1］羅婭，湯浩茹，張勇.低溫脅迫對草莓葉片 SOD和 ASAGSH循環(huán)酶系統的影響［J］.園藝學報，2007，34(6):1405－1410.

［2］陳少裕.膜脂過氧化對植物細胞的傷害［J］.植物生理學通訊，1991，27(2):84－90.

［3］江福英，李延，翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理［J］.福建農業(yè)學報，2002，17(3):190－195.

［4］楊華庚，陳慧娟.高溫脅迫對蝴蝶蘭幼苗葉片形態(tài)和生理特性的影響［J］.中國農學通報，2009，25(1):123－127.