康 超，楊 洋，李湘萍，何鑫平，黃時(shí)海，*

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005;2.廣西大學(xué)動(dòng)物繁殖研究所，廣西南寧530005)

鏈球菌分批發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸及其動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展

康 超1，楊 洋1，李湘萍2，何鑫平1，黃時(shí)海1，*

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005;2.廣西大學(xué)動(dòng)物繁殖研究所，廣西南寧530005)

透明質(zhì)酸(HA)是一種具有特殊生理功能的高分子糖，在醫(yī)藥和化妝品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。本文綜述了近年來(lái)透明質(zhì)酸發(fā)酵研究的一些進(jìn)展，并介紹了分批發(fā)酵中不同初糖濃度，pH，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程的影響及透明質(zhì)酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。

獸疫鏈球菌，HA，動(dòng)力學(xué)

Abstract:Hyaluronic acid(HA)is a kind of polysaccharide with special physical functions，and has been used widely in cosmetic and medical areas.In this summary，development of HA fermentation in recent years was introduced.The influence of different prime sugar concentration，pH and mixing speed in batch fermentation on cell growth and the product formation process was introduced.The kinetic models of HA fermentation was analysed.

Key words:Streptococcus Zooepidemicus;HA;Kinetic

透明質(zhì)酸(Haluronic acid，HA)是一種酸性粘多糖。HA作為一種天然降解且具有吸收性、可生物降解的生物醫(yī)學(xué)材料，在臨床上用途十分廣泛［1］。主要應(yīng)用于眼科、耳科、骨科和外科等［2］。HA具有保濕、營(yíng)養(yǎng)、潤(rùn)膚等作用，故其廣泛地用于各種高級(jí)化妝品中，與傳統(tǒng)的保濕劑相比，透明質(zhì)酸具有更高的保濕效果，且無(wú)油膩和阻塞皮膚等缺點(diǎn)，是國(guó)際公認(rèn)最好的保濕劑之一［3］，有“天然保濕因子(NMF)”的美稱。HA是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ纳锘ぎa(chǎn)品，而近年來(lái)市場(chǎng)的需求也與日俱增。其制備方法主要有動(dòng)物提取法和發(fā)酵法［4－6］。前者是國(guó)內(nèi)目前生產(chǎn)HA的主要方法，工藝流程都是先從皮膚、人臍帶、動(dòng)物眼球等組織中［7－9］提得粗產(chǎn)品，然后用酶解、超濾、離子交換等［10－11］技術(shù)進(jìn)一步去除雜質(zhì)及雜蛋白而得到純品。由于動(dòng)物組織原料有限、難以集中收集和處理、價(jià)格高、含量低等，用傳統(tǒng)的提取法［12］進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)比較困難。目前，透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法逐漸轉(zhuǎn)向主要以鏈球菌為生產(chǎn)菌種的微生物發(fā)酵法［2，13－14］，該方法具有產(chǎn)量不受原料限制、成本低、產(chǎn)量高、分離純化工藝簡(jiǎn)便，易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)成為透明質(zhì)酸生產(chǎn)的發(fā)展方向［15］。國(guó)外用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)HA已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，而我國(guó)利用發(fā)酵法生產(chǎn)HA的技術(shù)尚未成熟，規(guī)模小、產(chǎn)量低、成本高，產(chǎn)品缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。提取工藝不成熟導(dǎo)致提取率不高是一個(gè)原因，而HA發(fā)酵產(chǎn)率低則是現(xiàn)有工藝存在的主要問(wèn)題［1，16－17］。目前研究改進(jìn)措施還是沿用傳統(tǒng)的思路和方法，如菌種誘變篩選，培養(yǎng)基優(yōu)化，改進(jìn)發(fā)酵條件等，這方面已有許多相關(guān)的研究報(bào)道，也取得一定的進(jìn)展。而涉及狀態(tài)變量(菌體、底物等)隨時(shí)間的變化規(guī)律，及與其控制變量(溫度、pH等)之間的關(guān)系，以及動(dòng)力學(xué)模型等發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面研究的報(bào)道不多。我們知道，通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化控制，是提高發(fā)酵產(chǎn)率的有效途徑［18－19］。因此很有必要從動(dòng)力學(xué)的角度深入研究鏈球菌分批發(fā)酵生產(chǎn)HA的發(fā)酵過(guò)程，建立準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)模型，更好地預(yù)測(cè)、優(yōu)化和控制HA生產(chǎn)過(guò)程，從而提高HA的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 分批發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的動(dòng)力學(xué)模型

1.1 模型分類

目前一般將發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分成三個(gè)部分［19］:a.菌體生長(zhǎng)模型;b.產(chǎn)物合成模型;c.底物消耗模型。

1.2 菌體生長(zhǎng)模型

微生物菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)可由很多模型來(lái)描述，其中 Monod及 Logistic方程［20］最為簡(jiǎn)單和常用。Monod方程是應(yīng)用最普遍的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程，是一種理論化的簡(jiǎn)單模型，它不考慮菌體濃度增加對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，主要用來(lái)描述非抑制性單一底物限制情形下的細(xì)胞生長(zhǎng)，這種理想的情況是極少的。

其中，μ為某一微生物的比生長(zhǎng)速率，g/(g·h);S為培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度，g/L;Ks為稱作飽和常數(shù)的系統(tǒng)常數(shù)，g/L。

高海軍等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)，獸疫鏈球菌(Strptococcus zooepidemicus H23)在合成透明質(zhì)酸的過(guò)程中大部分碳源都轉(zhuǎn)化為乳酸。發(fā)酵液中乳酸的積累影響細(xì)胞生長(zhǎng)，是一種典型的產(chǎn)物抑制型生物過(guò)程。

在反映產(chǎn)物抑制的模型中，最具有代表性的是Converti et al［22］和 Novak［23］模型

其中，kp為產(chǎn)物抑制常數(shù)，g/L;ρp為產(chǎn)物質(zhì)量濃度，g/L;ρp，m為最大產(chǎn)物抑制濃度，g/L;a 為常數(shù)。

Han－Levenspiel［24］提出了適用于底物、產(chǎn)物和細(xì)胞各種抑制的普遍化經(jīng)驗(yàn)方程:

其中，c1為抑制物濃度;c*1為允許抑制物濃度最大值;n，m為常數(shù)。

高海軍等［21］根據(jù)功能單元假設(shè)和統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)理論的數(shù)學(xué)表達(dá)式，提出H23菌株生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型:

其中，μmax為菌體最大比生長(zhǎng)速率，/h;Ks為底物半飽和常數(shù)，g/L;KLA為乳酸抑制常數(shù);Ki為底物抑制常數(shù)，g/L;A、B1、B2、C 為常數(shù)。

羅瑞明等［25］在研究NUF－036菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)對(duì)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男薷牡贸?

其中，μmax為菌體最大比生長(zhǎng)速率，/h;ks為底物半飽和常數(shù)，g/L;ki為底物抑制常數(shù)，g/L;k1為乳酸對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制常數(shù);pLA為乳酸濃度。

以上動(dòng)力學(xué)模型建立都適當(dāng)考慮了菌體生長(zhǎng)受底物和產(chǎn)物抑制的動(dòng)力學(xué)行為。

1.3 產(chǎn)物合成模型

鏈球菌菌株厭氧發(fā)酵過(guò)程中，透明質(zhì)酸和乳酸是僅能檢出的產(chǎn)物，而在通風(fēng)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的乙酸［26］，但可以不考慮。

Luedeking 和 Piret［27］對(duì)產(chǎn)物形成速度與細(xì)胞生長(zhǎng)速率及細(xì)胞濃度的關(guān)系進(jìn)一步研究后，提出Luedeking－Piret方程，即式(8)

其中α，β為常數(shù)。

高海軍［21］等對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)一步分析，結(jié)合式(8)，提出H23菌株發(fā)酵過(guò)程中透明質(zhì)酸的動(dòng)力學(xué)模型如下:

式中，pLA為乳酸濃度，g/L;αHA為偶聯(lián)常數(shù)，g/L;k為乳酸對(duì)透明質(zhì)酸的抑制常數(shù)，為常數(shù)。

同樣，羅瑞明等［25］也提出了NUF－036菌株發(fā)酵過(guò)程HA形成的動(dòng)力學(xué)模型:

式中，pHA為 HA 濃度，g/L;αHA為偶聯(lián)常數(shù);k2為乳酸對(duì)HA合成的抑制常數(shù)。

這些動(dòng)力學(xué)模型是基于同樣的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和假設(shè)推導(dǎo)得到:HA和乳酸的生成與菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián)，乳酸對(duì)HA的合成有強(qiáng)烈的抑制作用，同時(shí)也會(huì)抑制自身的合成。

1.4 底物消耗模型

陳堅(jiān)等［23］綜合透明質(zhì)酸發(fā)酵過(guò)程，底物消耗的三種途徑:形成產(chǎn)物，供給細(xì)胞生長(zhǎng)，維持細(xì)胞呼吸新新陳代謝作用，提出底物消耗動(dòng)力學(xué)可以用下式表示

由于透明質(zhì)酸只占基質(zhì)消耗量的小部分?？梢詫⑼该髻|(zhì)酸項(xiàng)和菌體項(xiàng)合并;若底物對(duì)菌體和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率恒定，則式(9)可以簡(jiǎn)化為:

羅瑞明等［28］也提出NUF－036菌株生長(zhǎng)透明質(zhì)酸的底物消耗動(dòng)力學(xué)模型如下:

式中，Yx，YHA，YLA分別為底物對(duì)菌體、HA 及乳酸的轉(zhuǎn)化率，g/g;me為菌體的內(nèi)源維持常數(shù)，h－1。

以上菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型原理相對(duì)簡(jiǎn)單，是在相同或不同的假設(shè)條件下，結(jié)合不同的、經(jīng)典的動(dòng)力學(xué)公式推導(dǎo)而得，反映了鏈球菌利用廉價(jià)的葡萄糖轉(zhuǎn)化為HA的過(guò)程中，除底物葡萄糖的消耗、產(chǎn)物透明質(zhì)酸的生成外，還伴隨著乳酸、乙酸等副產(chǎn)物形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。雖然建摸時(shí)也考慮了底物和產(chǎn)物濃度等一些影響因素，但缺乏對(duì)分批發(fā)酵中復(fù)雜的生化過(guò)程的詳細(xì)分析，模型是簡(jiǎn)化和半經(jīng)驗(yàn)式的，其準(zhǔn)確度、可靠性和適用范圍受到一定的限制。

2 初糖濃度的影響

2.1 初糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

首先在控制pH的基礎(chǔ)上考察不同初糖濃度下獸疫鏈球菌菌株的發(fā)酵過(guò)程，高海軍等［21］在研究中發(fā)現(xiàn):初糖濃度為40g/L時(shí)，最有利于搖瓶發(fā)酵，在較低的初糖濃度下，菌體的生長(zhǎng)延遲期較短，而當(dāng)初糖濃度為93g/L時(shí)則有明顯的生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象。羅瑞明等［28］研究得出，隨著初糖濃度的提高HA產(chǎn)量下降，菌體進(jìn)入快速耗糖階段的時(shí)間隨初糖濃度升高而延遲。

2.2 初糖濃度對(duì)產(chǎn)物合成的影響

高海軍等［21］在研究S.zooepidemicus H23在不同初糖濃度下合成透明質(zhì)酸時(shí)發(fā)現(xiàn):透明質(zhì)酸合成與菌體生長(zhǎng)偶聯(lián)。張容鵠等［29］對(duì)Streptococcus equi SH－5生產(chǎn)透明質(zhì)酸的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該菌株在碳氮比為2∶1時(shí)有利于透明質(zhì)酸的合成和菌體的生長(zhǎng)，葡萄糖為5%對(duì)產(chǎn)酸有利。趙亞玲等［30］在搖瓶中進(jìn)行獸疫鏈球菌誘變株NW－162發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的工藝研究，得出最佳培養(yǎng)基的葡萄糖為40g/L，復(fù)合氮源為20g/L。羅瑞明等［31］在研究生產(chǎn)透明質(zhì)酸的獸疫鏈球菌NUF－035的篩選及搖瓶發(fā)酵條件，得出最優(yōu)培養(yǎng)基的葡萄糖為60g/L。吳明霞等［33］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)可溶性淀粉含量為2%，復(fù)合氮源為3%時(shí)，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.29倍之多。

葡萄糖是S.zooepidemicus發(fā)酵的最適碳源，從代謝流角度來(lái)考慮，可以認(rèn)為初糖質(zhì)量濃度的不同直接影響著碳源代謝的流向，初糖質(zhì)量濃度較高時(shí)，碳源更多的流向產(chǎn)物的合成。但過(guò)高的初糖濃度會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和HA的形成［26］。

3 pH的影響

3.1 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

pH是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累有很大的影響。發(fā)酵液pH影響微生物細(xì)胞原生質(zhì)的電荷，引起各種酶活力的變化，影響鏈球菌菌體對(duì)底物的利用速度和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，以致影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成［33］。

羅瑞明等［25］研究發(fā)現(xiàn):pH=7.5最適合細(xì)胞生長(zhǎng)，也最適合HA的合成，葡萄糖消耗也最徹底。高海軍等［21］在研究不同 pH下的生長(zhǎng)曲線時(shí)得出:pH7.0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最好。同樣，有外國(guó)研究人員［27］［35］發(fā)現(xiàn)，pH 高于 8.0 對(duì)乳酸合成有利，pH 對(duì)HA分子質(zhì)量影響不大，只有pH=6.0時(shí)HA分子質(zhì)量才顯著降低。

3.2 pH對(duì)產(chǎn)物合成的影響

高海軍等［21］發(fā)現(xiàn):pH7.0時(shí)透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高，表明pH7.0是透明質(zhì)酸合成的最適pH。不同pH下乳酸的最終產(chǎn)量是相同的(pH8.0除外)，但在pH6.5時(shí)，菌體合成乳酸速度最快;葡萄糖消耗速度也最快。pH對(duì)透明質(zhì)酸分子量影響不大，只有在pH6.0時(shí)分子量才明顯降低。

趙亞玲等［31］在研究中發(fā)現(xiàn)pH為7.0，裝料系數(shù)為0.4的工藝條件下，發(fā)酵至27～30h達(dá)到最優(yōu)發(fā)酵效果，收率比優(yōu)化前提高兩倍。汪嶸等［35］采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸，培養(yǎng)條件選擇pH6.5，培養(yǎng)48h，添加生長(zhǎng)因子，透明質(zhì)酸產(chǎn)量增加將近一倍。

綜上所述，pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成影響較大，高pH或者低pH都不利于發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，最佳的pH選擇是在中性附近。

4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響

4.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

高海軍等［37］在研究攪拌與混合對(duì)獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的影響時(shí)發(fā)現(xiàn):攪拌轉(zhuǎn)速越高，菌體生長(zhǎng)速度越快，在較高的攪拌速率下發(fā)酵時(shí)還可以得到較高的透明質(zhì)酸產(chǎn)量，只有在高攪拌轉(zhuǎn)速時(shí)發(fā)酵體系才處于全部混合狀態(tài)。

4.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)物合成的影響

羅瑞明等［25］發(fā)現(xiàn)攪拌速度為700r/min時(shí)，HA產(chǎn)量隨攪拌速度的增加而增加，但分子質(zhì)量下降。攪拌轉(zhuǎn)速為900r/min時(shí)，HA分子質(zhì)量和產(chǎn)量都大幅下降，最適攪拌速度為650r/min。高海軍也發(fā)現(xiàn)，攪拌轉(zhuǎn)速為650r/min，有利于獸疫鏈球菌H23發(fā)酵生產(chǎn)HA。

張容鵠，馮建成等［37］的研究表明，菌體生長(zhǎng)和高分子量HA的生產(chǎn)是同步的，攪拌轉(zhuǎn)速為550r/min時(shí)，有利于HA的生產(chǎn)。研究結(jié)果產(chǎn)生較大的差異，張認(rèn)為原因可能是馬疫鏈球菌SH－109是由生長(zhǎng)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌SH－0突變而來(lái)，其最適生長(zhǎng)pH偏堿性環(huán)境，屬于堿性厭氧菌，而體外發(fā)酵條件優(yōu)化的結(jié)果與天然生長(zhǎng)環(huán)境相吻合。

綜合上述:攪拌對(duì)發(fā)酵體系的傳質(zhì)有著重要的影響，但過(guò)高的攪拌速度，會(huì)產(chǎn)生很大的剪切作用，可能對(duì)所培養(yǎng)的菌體細(xì)胞造成傷害，影響絲狀透明質(zhì)酸分子的分子量。透明質(zhì)酸溶液是一種高粘度的非牛頓型流體，具有常見(jiàn)發(fā)酵液所沒(méi)有的流變學(xué)性質(zhì)，使得攪拌在透明質(zhì)酸發(fā)酵過(guò)程中具有特殊的作用［28，33］。

5 總結(jié)

目前，通過(guò)分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，建立模型，計(jì)算機(jī)擬合驗(yàn)證，實(shí)際應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，減少了原料消耗，提高了發(fā)酵產(chǎn)率的例子不少［38－39］。而對(duì)于透明質(zhì)酸生產(chǎn)，盡管發(fā)酵法的優(yōu)勢(shì)日益顯現(xiàn)出來(lái)，人們已開始重視其有關(guān)發(fā)酵特性、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，但是迄今為止，相關(guān)報(bào)道不多，并存在很多迫切需要解決的問(wèn)題。比如對(duì)HA發(fā)酵過(guò)程控制來(lái)說(shuō)，還未徹底弄清楚發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)的代謝變化途徑與調(diào)控機(jī)制、酶催化機(jī)理與微生物酶催化體系，物質(zhì)與能量的傳遞方式、細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖規(guī)律與生態(tài)環(huán)境等各種影響發(fā)酵的因素，也就無(wú)法從理論上確定該發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化控制的條件和方法。其次，現(xiàn)在建立的各種HA發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，都是通過(guò)經(jīng)驗(yàn)法、半經(jīng)驗(yàn)法或簡(jiǎn)化法得到，屬非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型。這些模型形式簡(jiǎn)單，數(shù)字處理方便，但沒(méi)有反映存在于細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝過(guò)程，因此，其應(yīng)用受到一定的局限。隨著生物、化學(xué)、物理學(xué)科的相互交叉以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅速發(fā)展，人們對(duì)鏈球菌分批發(fā)酵生產(chǎn)HA發(fā)酵過(guò)程控制的復(fù)雜性、菌體生長(zhǎng)代謝特殊性等都會(huì)有更準(zhǔn)確的、定量的認(rèn)識(shí)和描述，這些都會(huì)促使研究人員提出更精確的動(dòng)力學(xué)模型。而如何將這些適用范圍更廣的模型與生物反應(yīng)器自控技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，應(yīng)用于HA小罐實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的放大、發(fā)酵工藝參數(shù)精密調(diào)節(jié)和補(bǔ)料控制等方面，從而指導(dǎo)HA發(fā)酵過(guò)程，提高產(chǎn)率和生產(chǎn)效益，將是今后發(fā)酵法生產(chǎn)HA研究的一個(gè)方向和熱點(diǎn)。

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Advance in haluronic acid batch fermentation by Streptococcus and its kinetic study

KANG Chao1，YANG Yang1，LI Xiang－ping2，HE Xin－ping1，HUANG Shi－h(huán)ai1，*
(1.Life Science and Technology College，Guangxi University，Nanning 530005，China;2.Animal Reproduction Institute，Guangxi University，Nanning 530005，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0383－05

2009－07－16 *通訊聯(lián)系人

康超(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品與微生物發(fā)酵工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30660126);廣西青年科學(xué)基金(桂科青0339006)。