李曉雁，黃海東，甄潤(rùn)英，牛國(guó)君

(天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，天津300384)

苦蕎內(nèi)生菌的分類鑒定及對(duì)黃酮合成的影響

李曉雁，黃海東，甄潤(rùn)英，牛國(guó)君

(天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，天津300384)

從苦蕎中分離得到2株內(nèi)生菌N3和XJ01，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定這2株苦蕎內(nèi)生菌屬于腸桿菌科泛菌屬。用內(nèi)生菌及其多糖類提取物對(duì)萌發(fā)苦蕎進(jìn)行處理，結(jié)果表明，N3和XJ01提取物能誘導(dǎo)苦蕎樣品中苯丙氨酸氨解酶的活性升高，進(jìn)而促進(jìn)萌發(fā)苦蕎的黃酮合成。內(nèi)生菌提取物的最佳使用濃度均為50mg/L，經(jīng)N3提取物處理的苦蕎黃酮含量最高，達(dá)到4.59%，比對(duì)照提高15.3%。

苦蕎，黃酮，內(nèi)生菌，苯丙氨酸氨解酶

Abstract:Strains N3 and XJ01 were isolated from tartary buckwheat.According to the characteristics of morphology，physiology and biochemistry tests and the comparison of 16S rDNA sequence.Strains N3 and XJ01 were identified as Pantoea sp..Endophyte and its extract were used to induce germinating tartary buckwheat product flavonoids.The results showed that the activity of phenylalanine ammonialyase increased by the treatment of extract N3 and XJ01.The production of flavonoids was stimulated during germination.The optimal concentration of extract N3 and XJ01 was 50mg/L.After treated by N3 extract，the content of flavonoids reached 4.59%，and the content was 15.3%higer than that in CK.

Key words:tartary buckwheat;flavonoids;endophyte;phenylalanine ammonialyase

黃酮類化合物是苦蕎籽粒中的藥用生物活性成分，它是一種次生代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)改變植物生長(zhǎng)環(huán)境中的某些條件調(diào)控其合成量［1］。植物在受到外界因子如微生物或化學(xué)、物理因素的刺激時(shí)，自身會(huì)發(fā)生防御反應(yīng)，從而造成次生代謝物合成量的變化［2］，啟動(dòng)這些防御機(jī)制的誘導(dǎo)劑可分為非生物性和生物性兩種，非生物性誘導(dǎo)劑有紫外照射、金屬離子等，生物性誘導(dǎo)劑包括微生物菌體細(xì)胞及其提取液等。植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織中，而不引起植物組織明顯病變的微生物，這些內(nèi)生菌的代謝行為會(huì)影響宿主植物的生長(zhǎng)和次生代謝物的合成［3］。本文對(duì)苦蕎內(nèi)生菌進(jìn)行了分離鑒定，并研究了內(nèi)生菌對(duì)苦蕎萌發(fā)過(guò)程中黃酮合成的影響，為提高苦蕎黃酮的合成量提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榆6－21苦蕎 由山西省壽陽(yáng)蕎麥協(xié)會(huì)提供。

Biofuge高速冷凍離心機(jī) Heraeus公司;Tgradient型PCR儀 Biometra公司;DYY－6B型電泳儀、WD－9403F型紫外分析儀 北京六一儀器廠;LRH－150B生化培養(yǎng)箱 廣東醫(yī)療器械廠;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮公司;HYG－III回旋式搖床

上海新蕊公司;HH－Z4恒溫水浴 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司;752型紫外光柵分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎內(nèi)生菌的分離 取苦蕎種子和萌發(fā)苦蕎的一段幼莖，用自來(lái)水洗凈，無(wú)菌水沖洗2次，用無(wú)菌濾紙吸干水分;在75%乙醇溶液中浸泡1min，濾紙吸干后，在0.2%的升汞溶液中浸泡1min，無(wú)菌水沖洗5次，濾紙吸干。在無(wú)菌條件下用刀片將樣品剖開(kāi)，將截面置于PDA培養(yǎng)基平板內(nèi)，30℃培養(yǎng)4～8d。待平板有菌長(zhǎng)出后，平板劃線純化，直至得到單菌落，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)生菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定 在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)體形態(tài)，并測(cè)定菌體大小。細(xì)菌的革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性觀察、甲基紅(M.R)、V－P測(cè)定、葡萄糖發(fā)酵、氧化酶、接觸酶、脲酶、吲哚等實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

1.2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 在LB培養(yǎng)基中接種內(nèi)生菌，搖床培養(yǎng)24h，取5mL菌液離心，得到的菌體用0.5mol/L NaCl洗1次，用1mg/mL溶菌酶溶液懸浮菌體，37℃作用30min，用上海生工生物工程有限公司UNIQ－10試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物 27F(5'－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和1541R(5'－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3')擴(kuò)增得到目的基因片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后與pGEM－T easy載體(Promega公司)連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，用X－gal平板篩選含有插入DNA片斷的白色轉(zhuǎn)化子，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后送北京三博公司測(cè)序。將得到的16S rDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，搜索得到與其同源性最高的相關(guān)序列，采用軟件ClustalX1.8對(duì)所獲得的核苷酸序列進(jìn)行分析，得到序列之間的相似值;用軟件MEGA2.0計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離［5］，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑的制備 將分離得到的內(nèi)生菌接種于 LB液體培養(yǎng)基中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，180r/min、30℃ 培養(yǎng) 2d，10000r/min 離心 20min 后，收集上清液，加入2倍體積的乙醇沉淀多糖，去離子水沖洗后置于80℃烘箱中干燥，用水溶解至一定濃度備用。

1.2.5 內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑多糖含量測(cè)定 蒽酮比色法測(cè)定內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑的多糖含量。

1.2.6 苦蕎總黃酮提取與測(cè)定 以甲醇為提取液，采用索氏提取法提取不同處理苦蕎樣品中的總黃酮;以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，三氯化鋁比色法測(cè)定總黃酮含量［6］。

1.2.7 內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑的效果 挑選顆粒飽滿的苦蕎種子分別置于蒸餾水、內(nèi)生菌發(fā)酵液以及100mg/L糖濃度的不同內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑溶液中浸泡24h，將浸泡后的種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙(用水、內(nèi)生菌發(fā)酵液和相應(yīng)的誘導(dǎo)劑溶液潤(rùn)濕)的培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下萌發(fā)，每個(gè)不同處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，7d后收獲苦蕎幼苗，測(cè)定樣品的總黃酮含量。以多糖含量為指標(biāo)，調(diào)整內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑溶液濃度為 10、50、100、200、400mg/L，處理苦蕎樣品，測(cè)定樣品的總黃酮含量。

1.2.8 苯丙氨酸氨解酶的提取與活性測(cè)定 根據(jù)苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)和雜蛋白在高濃度鹽溶液中的電荷和溶解度的不同，進(jìn)行分級(jí)沉淀初步分離提取PAL。利用離心鹽析法提取苦蕎樣品中的苯丙氨酸氨解酶，以紫外分光光度法測(cè)定 PAL的酶活性［7］，以每小時(shí)在290nm處0.01OD變化為一個(gè)酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎內(nèi)生菌的分離和分類鑒定

2.1.1 菌體特征及菌落特征 從苦蕎種子和萌發(fā)的苦蕎樣品中分別得到2株內(nèi)生菌，XJ01和N3。2種內(nèi)生菌在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，在LB培養(yǎng)基平板中生長(zhǎng)較迅速，30℃培養(yǎng)4d，菌株N3形成的菌落直徑3～4mm，圓形且邊緣整齊、凸起，黃色、質(zhì)地粘稠(圖1);N3菌體細(xì)胞形態(tài)為直桿狀，大小0.3～0.8μm×0.9～1.5μm，革蘭氏陰性，無(wú)芽孢、有鞭毛，胞內(nèi)有異染粒。相同條件下，菌株XJ01形成的菌落直徑3～5mm，近似圓形，明顯隆起，邊緣褶皺無(wú)規(guī)則，淡黃色，培養(yǎng)初期菌落干燥，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌落粘稠;XJ01菌體細(xì)胞為桿狀，大小0.5～1.0μm×1.0～2.0μm，革蘭氏陰性，無(wú)芽孢、有鞭毛，胞內(nèi)有異染粒和類脂顆粒。

圖1 內(nèi)生菌的菌落形態(tài)特征

2.1.2 生理生化特性 菌株N3和XJ01均為兼性厭氧菌，N3的生長(zhǎng)溫度范圍為8～40℃，XJ01的生長(zhǎng)溫度范圍為4～40℃，2種內(nèi)生菌的pH生長(zhǎng)范圍均為5.0～8.5，其他生理生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在明膠液化和精氨酸雙水解酶的結(jié)果上N3和XJ01有差別。2種內(nèi)生菌均可以利用以下碳源:葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、樹(shù)膠醛糖和甘油;都不能利用淀粉、海藻糖和乙酸鹽為唯一碳源生長(zhǎng)。

表1 菌株N3和XJ01的生理生化特征

2.1.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 PCR擴(kuò)增得到菌株N3和XJ01的16S rDNA片斷，經(jīng)DNA測(cè)序長(zhǎng)度分別為 1520bp和 1513bp，在 GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登記號(hào)為GQ853415和GQ853416。將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明這2株苦蕎內(nèi)生菌與腸桿菌科泛菌屬(Pantoea sp.)的同源性較高，將其與泛菌屬全部8個(gè)種的菌株以及Pandoraea屬的細(xì)菌進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，從圖2可以看出，菌株N3、XJ01與泛菌屬(Pantoea sp.)的菌株都劃分在同一簇內(nèi)，且與Pantoea agglomerans DSM 3493的同源性最高，分別為97.9%和97.8%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征指標(biāo)，可以確定苦蕎內(nèi)生菌N3和XJ01屬于泛菌屬。

圖2 菌株N3和XJ01的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 內(nèi)生菌對(duì)苦蕎種子萌芽過(guò)程中黃酮含量的影響

內(nèi)生菌對(duì)苦蕎萌發(fā)過(guò)程中黃酮合成的影響如圖3所示，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分有利于苦蕎的萌發(fā)，黃酮合成量比對(duì)照提高2.2%，而使用內(nèi)生菌N3和 XJ01菌液后，黃酮合成量提高8.0%和3.5%，說(shuō)明內(nèi)生菌對(duì)苦蕎的黃酮合成有一定的促進(jìn)作用;提取內(nèi)生菌的多糖類物質(zhì)為誘導(dǎo)劑，在相同的條件下，N3和XJ01誘導(dǎo)劑能使黃酮合成量提高12.7%和4.2%，說(shuō)明內(nèi)生菌合成的多糖類代謝產(chǎn)物是誘導(dǎo)黃酮合成增加的主要因素。

圖3 內(nèi)生菌對(duì)苦蕎黃酮合成的影響

2.3 不同濃度誘導(dǎo)劑對(duì)苦蕎黃酮合成的影響

配制不同濃度梯度的內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑溶液，處理萌發(fā)過(guò)程中的苦蕎樣品，結(jié)果(圖4)表明，2種內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑的最佳使用濃度均為50mg/L，在該濃度條件下N3和XJ01誘導(dǎo)劑的效果最好，苦蕎樣品的總黃酮含量達(dá)到4.59%和4.35%，與對(duì)照相比提高了15.3%和9.3%。但過(guò)高濃度的誘導(dǎo)劑會(huì)抑制苦蕎的萌發(fā)，N3提取物的濃度達(dá)到400mg/L，XJ01提取物的濃度達(dá)到200mg/L以上，樣品的黃酮合成量下降。

圖4 不同濃度內(nèi)生菌提取物對(duì)苦蕎黃酮合成的影響

2.4 內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑對(duì)苦蕎苯丙氨酸氨解酶活性的影響

苯丙氨酸氨解酶(PAL)是催化黃酮合成代謝第一步反應(yīng)的酶，是苦蕎黃酮合成代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，眾多研究表明，PAL活性高低與黃酮類次生代謝物的形成關(guān)系密切［6］。取誘導(dǎo)劑處理前后的苦蕎樣品，提取PAL，并用紫外分光光度法測(cè)定酶的活性，結(jié)果如表2所示。從樣品總黃酮含量和PAL活性關(guān)系來(lái)看，未萌發(fā)苦蕎種子中的PAL活性為0.3個(gè)活性單位，萌發(fā)后的苦蕎幼苗(CK)的PAL活性為1.9個(gè)活性單位，同時(shí)樣品的黃酮合成量提高2.8倍。PAL是一種誘導(dǎo)酶，可以受物理、化學(xué)和生物等多種因素的誘導(dǎo)，用N3和XJ01誘導(dǎo)劑處理苦蕎后，PAL活性分別提高1.9和1.5倍，說(shuō)明內(nèi)生菌的多糖類誘導(dǎo)劑對(duì)萌發(fā)過(guò)程中的苦蕎次生代謝有刺激作用，誘導(dǎo)PAL活性升高，從而促進(jìn)黃酮類化合物的合成。

表2 苦蕎樣品中的總黃酮含量和PAL活性

3 結(jié)論

從生態(tài)學(xué)的角度講，任何生活在自然環(huán)境中的植物體內(nèi)都存在內(nèi)生菌［8］，在內(nèi)生菌與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的共生關(guān)系，許多內(nèi)生菌都能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，是一種重要的微生物資源。本文從苦蕎中分離得到2株內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定都屬于腸桿菌科泛菌屬，用這2種內(nèi)生菌及其多糖類提取物分別處理苦蕎，結(jié)果表明都可以促進(jìn)萌發(fā)苦蕎的黃酮合成，且內(nèi)生菌提取物的效果優(yōu)于菌液?？嗍w所含的黃酮類活性物質(zhì)具有重要的生理功能和較高的保健與藥用價(jià)值，利用內(nèi)生菌誘導(dǎo)劑處理苦蕎，提高黃酮類活性物質(zhì)的合成，對(duì)苦蕎保健類相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

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Identification of endophyte from tartary buckwheat and its influence on synthesis of flavonoids

LI Xiao－yan，HUANG Hai－dong，ZHEN Run－ying，NIU Guo－jun
(Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0118－03

2009－09－10

李曉雁(1971－)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品分析的研究工作。

天津農(nóng)學(xué)院科學(xué)研究發(fā)展基金項(xiàng)目(2006015)。