肖 陽(yáng)，孫寶國(guó)，廖永紅，沈 晗，石文娟，任文雅

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100048)

一株葡萄酒Pichia sp.菌的分離鑒定及其產(chǎn)香成分分析

肖 陽(yáng)，孫寶國(guó)，廖永紅*，沈 晗，石文娟，任文雅

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100048)

從葡萄酒泥中分離得到一株產(chǎn)香能力強(qiáng)的酵母菌株，經(jīng)Biolog鑒定為Pichia sp.菌種，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較短，210h內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)定性良好，能利用麥芽糖、麥芽三糖、棉子糖、蔗糖等8種碳源;菌種發(fā)酵產(chǎn)香為酯香，經(jīng)GC－MS分析可知，其香味成分主要為乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛等。

葡萄酒泥，產(chǎn)香酵母，Biolog，GC－MS

Abstract:A yeast separated from the grape wine mud had strong aroma－producing abilities.The result of the Biolog system identification showed that the yeast belongs to Pichia sp.The yeast had a short exponential phase and good stabilities in 210h.8 kinds of carbon sources such as Maltose，Maltotriose，Raffinose，Sucrose and so on could be utilized.Analyzed by GC－MS，the fermentation flavors come from esters including ethyl acetate，ethanol，4－－OH－2－ butanone，benzaldehyde and so on.

Key words:grape wine mud;ester－producing yeasts;Biolog;GC－MS

產(chǎn)香酵母在葡萄酒釀造中有著非常重要的作用，這些酵母主要分布于果皮表面、園區(qū)土壤、自然發(fā)酵醪液以及酒廠等環(huán)境中［1］，它們能代謝產(chǎn)生多種酶，如β－糖苷酶、蛋白酶、酯酶等，這些酶酶解葡萄汁中的各種營(yíng)養(yǎng)成分，產(chǎn)生不同的風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予葡萄酒特有的香氣［2－3］。酵母菌的分類(lèi)鑒定方法有很多種，其中Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定是根據(jù)酵母菌對(duì)糖、醇、酸、酯等多種碳源的利用情況來(lái)快速鑒定出酵母菌的種屬，較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定更快速、簡(jiǎn)便［4］。利用動(dòng)、靜態(tài)頂隙色譜法、高效液相色譜和GC－MS等法對(duì)酵母發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分進(jìn)行分析，能夠?yàn)榻湍赴l(fā)酵產(chǎn)香的廣泛應(yīng)用提供有力依據(jù)［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Biolog微生物系統(tǒng)對(duì)葡萄酒泥樣品中分離純化得到的一株產(chǎn)香酵母菌進(jìn)行鑒定，并利用GC－MS對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)香成分進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒泥，YPD培養(yǎng)基，豆芽汁培養(yǎng)基。

滅菌鍋，LRH－250型生化培養(yǎng)箱，130S超凈工作臺(tái)，Biolog微生物自動(dòng)鑒定儀，GC，GC－MS，紫外分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 取葡萄酒泥5g，加入100mL無(wú)菌生理鹽水，浸泡15min后搖勻，取上清液0.1mL逐級(jí)稀釋到10－6，取各梯度稀釋液于YPD培養(yǎng)基平板稀釋涂布，28℃培養(yǎng)48h后，挑取酵母菌落特征的單菌落，制成不同濃度菌懸液，再度稀釋涂布，重復(fù)3～4次，直至獲得純菌種，用YPD斜面劃線保藏。

1.2.2 酵母產(chǎn)香能力比較 無(wú)菌操作下取活化酵母菌懸液1mL，接種入20mL豆芽汁培養(yǎng)基的試管中，28℃靜置培養(yǎng)48h后感官評(píng)定［6］，5項(xiàng)評(píng)定指標(biāo)分為10個(gè)等級(jí)，10名評(píng)定人員按標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)分，記錄并統(tǒng)計(jì)分值。感官評(píng)定指標(biāo)項(xiàng)目及分級(jí)見(jiàn)表1。

1.2.3 產(chǎn)香酵母Biolog系統(tǒng)鑒定［7］將純化好的產(chǎn)香能力強(qiáng)的待測(cè)菌株，嚴(yán)格按Biolog鑒定要求的操作規(guī)程進(jìn)行菌株鑒定。

表1 產(chǎn)香感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 產(chǎn)香酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［8］按5%接種量將酵母菌接入250mL豆芽汁培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)，每隔3h測(cè)定酵母細(xì)胞濃度的OD600值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 產(chǎn)香酵母的碳源利用分析 Biolog系統(tǒng)鑒定用的96微孔板，共提供了67種碳源，根據(jù)每孔顯色反應(yīng)數(shù)值大小即可分析出酵母菌的碳源利用情況。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)香成分的GC－MS及GC分析［9－10］活化酵母菌懸液0.5mL接入9.5mL豆芽汁液體培養(yǎng)基中(平行做7支試管)，28℃靜置發(fā)酵，每隔24h取1支進(jìn)行GC－MS或GC分析。先采用頂空固相微萃取法對(duì)發(fā)酵完樣品進(jìn)行預(yù)處理，其條件為CAR/PDMS 75μm Black萃取頭將發(fā)酵液 10mL于 50℃萃取20min;后續(xù)GC條件為采用VF－5ms 30m×0.25mm×0.25μm毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度250℃，起始溫度35℃，保留1min，以5℃/min升至260℃，保留3min;MS條件為離子源230℃，接口230℃，電離方式EI，電離電壓 70eV，檢測(cè)器電壓 0.96kV，掃描范圍29～350m/z，掃描方式Scan。收集各峰進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索即可得香氣成分物質(zhì)名稱(chēng)及含量，將各時(shí)間段的發(fā)酵樣品進(jìn)行GC分析即可得目標(biāo)物質(zhì)含量隨時(shí)間的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌分離與純化

將葡萄酒泥樣按1.2.1的方法進(jìn)行菌種分離，得到7株不同菌落特征的酵母菌株，分別編號(hào)1#～7#，劃線低溫保藏。

2.2 產(chǎn)香酵母的篩選

對(duì)分離出的7株菌株按1.2.2的方法進(jìn)行產(chǎn)香能力比較，挑選得分最高的菌株并標(biāo)記為CX－1，其細(xì)胞形態(tài)近圓形，無(wú)出芽，在平板培養(yǎng)時(shí)菌落近圓形、白色、凸起明顯、較為粘稠，而在液體培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生較多沉淀，無(wú)菌璞。

2.3 產(chǎn)香酵母Biolog系統(tǒng)鑒定

按Biolog系統(tǒng)鑒定操作要求對(duì)CX－1進(jìn)行鑒定，結(jié)果為Pichia sp.(畢赤氏酵母屬)，其培養(yǎng)24h時(shí)的相似度達(dá)0.679，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。Pichia sp.在葡萄酒發(fā)酵中期，即酒精含量達(dá)到3%～4%時(shí)占優(yōu)勢(shì)，對(duì)葡萄酒釀造有重要作用。相關(guān)研究可知，Pichia sp.還能利用甘油發(fā)酵產(chǎn)1，3－二羥基丙酮［11］，能利用紅橡木酸水解物發(fā)酵產(chǎn)乙醇［12］，同時(shí)也是真核基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建常見(jiàn)的一種菌種［13］，但關(guān)于Pichia sp.的生長(zhǎng)代謝及其發(fā)酵產(chǎn)香的系統(tǒng)研究未見(jiàn)報(bào)道。

2.4 產(chǎn)香酵母的發(fā)酵產(chǎn)香性能的初步研究

2.4.1 產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線 細(xì)胞的生長(zhǎng)性能是工業(yè)發(fā)酵利用微生物的重要指標(biāo)，按1.2.4的方法對(duì)Pichia sp.菌種進(jìn)行生長(zhǎng)曲線及培養(yǎng)液pH的測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線及pH變化曲線

從圖1可知，Pichia sp.菌種生長(zhǎng)的停滯期較短，在12h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，且細(xì)胞濃度在所測(cè)試的168h內(nèi)一直維持穩(wěn)定，說(shuō)明Pichia sp.菌種適應(yīng)性良好，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)繁殖能力，且細(xì)胞穩(wěn)定性好，不易發(fā)生衰亡和自溶，可以進(jìn)行工業(yè)產(chǎn)香發(fā)酵研究。

Pichia sp.菌種的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物使得培養(yǎng)液的pH也隨著發(fā)生改變，穩(wěn)定期之前，pH下降較快，進(jìn)入穩(wěn)定期之后pH變化不明顯。

2.4.2 產(chǎn)香酵母的碳源利用 Biolog鑒定用的96微孔板中含有67種不同的碳源，菌種利用這些碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生不同的顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)數(shù)值的大小即可判斷出酵母的碳源利用情況。圖2顯示了Pichia sp.菌種在不同時(shí)刻對(duì)這些碳源的利用情況。

圖2 Pichia sp．不同時(shí)刻的碳源利用

從圖2可知，Pichia sp.菌種能利用8種碳源，對(duì)不同的碳源其利用率也各異，其中利用率最高是蔗糖，其次是α－D－葡萄糖;同一碳源在不同時(shí)間的利用率大小也各異，蔗糖、α－D－葡萄糖、松二糖、麥芽糖和棉子糖在24h時(shí)利用最大，而其他3種碳源則在48h達(dá)到最大;由于棉子糖會(huì)導(dǎo)致在甜菜制糖工藝中蔗糖結(jié)晶難以析出而產(chǎn)生大量的廢糖蜜［14］，從資源利用角度出發(fā)，可以利用Pichia sp.菌種先行降解棉子糖，從而加速蔗糖的結(jié)晶析出，減少?gòu)U糖蜜產(chǎn)生。

2.4.3 發(fā)酵產(chǎn)香成分分析 產(chǎn)香酵母在發(fā)酵時(shí)代謝產(chǎn)生多種物質(zhì)，如醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)等，這些物質(zhì)含量各異且具有不同的香氣特征，從而構(gòu)成了酵母菌特有的發(fā)酵香氣，按1.2.6的方法對(duì)Pichia sp.菌種的發(fā)酵香氣成分進(jìn)行GC－MS分析，得GC－MS譜圖見(jiàn)圖3，檢索各峰物質(zhì)名稱(chēng)及峰面積見(jiàn)表2。

表2 Pichia sp.菌種發(fā)酵香氣成分名稱(chēng)及含量

圖3 Pichia sp.菌種發(fā)酵香氣成分的GC/MS譜圖

從表2可知，Pichia sp.菌種發(fā)酵香氣總體呈現(xiàn)為酯香，其香氣成分主要為乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛。其中乙酸乙酯具有柔和的果香和奶油味，并已用作仿造奶油、葡萄和草莓的香氣物質(zhì)［15］;4－羥基－2－丁酮具有愉快的牛奶香味、甜香味等;苯甲醛具有苦杏仁味，具有導(dǎo)致氣味加成或協(xié)同作用的效果，是非常有效的風(fēng)味修飾劑［16］，由此可見(jiàn)，葡萄酒曲中的Pichia sp.菌種對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程中所形成的特征香氣是很重要的。

取不同時(shí)段的發(fā)酵液按1.2.6的方法進(jìn)行GC分析，即可得到Pichia sp.菌種發(fā)酵香氣主要成分含量變化，見(jiàn)圖4。

圖4 Pichia sp.菌種發(fā)酵主要香氣成分含量變化

從圖4可知，由于菌種在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)代謝旺盛，Pichia sp.菌利用發(fā)酵液中的氨基酸，通過(guò)脫氨、脫羧、還原、縮合作用大量生成醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)，主要發(fā)酵香氣物質(zhì)在這此期間(0～24h)大量產(chǎn)生。進(jìn)入穩(wěn)定期(24h以后)各風(fēng)味物質(zhì)含量相對(duì)穩(wěn)定，其中乙酸乙酯的含量稍有增多，而乙醇的含量逐漸略有減少，這是因?yàn)榉€(wěn)定期的pH較低，有利于醇類(lèi)物質(zhì)在一定程度上向酯類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化(酸類(lèi)+醇類(lèi)?酯類(lèi))，但4－羥基－2－丁酮及苯甲醛則基本保持不變。

3 結(jié)論

從葡萄酒泥樣品中分離得到一株產(chǎn)香能力強(qiáng)的Pichia sp.菌種，它適應(yīng)性良好，具有較短的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且穩(wěn)定性良好，能夠利用蔗糖、α－D－葡萄糖、松二糖等8種碳源，其中對(duì)蔗糖的利用率最高。

Pichia sp.菌種發(fā)酵產(chǎn)香的香型主體為酯香，主要含有乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛等香氣成分，這些物質(zhì)主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大量產(chǎn)生，進(jìn)入穩(wěn)定期后，乙醇含量略有減少，乙酸乙酯含量稍增，其他物質(zhì)含量基本不變。

我國(guó)葡萄酒生產(chǎn)主要依靠活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，不僅使產(chǎn)品的同質(zhì)化效應(yīng)加劇，同時(shí)也抑制自然界中釀酒酵母及其它野生酵母的進(jìn)化發(fā)展，大自然的寶貴資源沒(méi)有充分利用。近年來(lái)，國(guó)外已經(jīng)越來(lái)越重視非釀酒酵母和野生酵母對(duì)葡萄酒的作用。加強(qiáng)葡萄酒酵母的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)香特性的研究，對(duì)我國(guó)葡萄酒的發(fā)展具有十分重要的意義。

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Identification and aroma components analysis of Pichia sp.yeast separated from grape wine mud

XIAO Yang，SUN Bao－guo，LIAO Yong－h(huán)ong*，SHEN Han，SHI Wen－juan，REN Wen－ya
(Institute of the Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

TS262.6

A

1002－0306(2010)08－0164－04

2009－02－22 *通訊聯(lián)系人

肖陽(yáng)(1967－)，男，本科，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:風(fēng)味食品應(yīng)用化學(xué)。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAK36B05)。