任曉莉，趙 林，趙潤柱

(1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072;2.太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008)

檸檬酸發(fā)酵生產菌種黑曲霉的選育

任曉莉1，2，趙 林1，*，趙潤柱2

(1.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津300072;2.太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008)

對檸檬酸生產菌種黑曲霉進行了85℃高溫和亞硝基胍復合誘變研究，確定了黑曲霉單孢子懸液適宜的誘變條件，溫度為85℃高溫，水浴時間為10min，質量濃度為1mg/mL亞硝基胍溶液的處理時間為4min，通過對復合誘變后的菌株進行平板初篩和搖瓶復篩，獲得了一株遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株TN－02，平均產酸率為13.61%，與出發(fā)菌株相比，產酸增幅達到43.20%。

黑曲霉，高溫，亞硝基胍，誘變

Abstract:For the breeding of Aspergillus niger for nitric acid fermentation，the relationship between the survival rate and mutagenic time were researched，the results showed the optimal time for 85℃，mutation bath time was 10 min，and 4min for 1mg/mL NTG mutation.In addition，by using 85℃ and NTG compound mutation，high－yielding and genetic stability strains TN－02 was obtained，acidogenic rate reached 13.61%and raises 43.2%compared to that of the original strain.

Key words:Aspergillus niger;high temperature;NTG;mutation

檸檬酸也稱枸椽酸，廣泛應用于香料或作為飲料的酸化劑，在食品和醫(yī)學上用作多價螯合劑，也是一種非常重要的化學中間體。檸檬酸發(fā)酵生產目前所采用的菌種主要是黑曲霉菌種和酵母菌菌種，而淀粉質原料發(fā)酵主要以黑曲霉菌種為主，對于檸檬酸發(fā)酵行業(yè)來說，菌種產酸水平的高低是決定檸檬酸發(fā)酵生產的關鍵因素之一，因此，檸檬酸菌種黑曲霉的選育研究一直成為科研人員關注的焦點，國內外有很多關于檸檬酸發(fā)酵菌種黑曲霉選育的研究報道［1－4］。我國檸檬酸生產菌種的發(fā)酵水平經過幾十年的努力，工業(yè)產酸水平平均達到13%以上，盡管我國檸檬酸發(fā)酵技術在世界上暫時處于領先地位，但菌種選育方面的競爭依然形勢嚴峻［5］，目前對檸檬酸生產菌種黑曲霉菌的選育仍以常規(guī)誘變?yōu)橹?，較為有效的誘變因子有:UV(紫外線)、激光、Co－射線、γ－射線、NTG(亞硝基胍)、EMS(甲基磺酸乙酯)等［6－9］，為了提高誘變效果，主要以復合誘變?yōu)橹?。本論文對高溫和亞硝基胍復合誘變檸檬酸生產菌種黑曲霉菌進行了實驗研究，所提供的誘變方法對于獲得檸檬酸生產高產菌株，促進檸檬酸行業(yè)的發(fā)展有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉(Aspergillus niger) 由實驗室保存，經斜面活化篩選后作為出發(fā)菌株和對照菌株;斜面培養(yǎng)基 察氏瓊脂培養(yǎng)基;篩選培養(yǎng)基 察氏瓊脂培養(yǎng)基添加0.04%溴甲酚綠指示劑;搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)基 NH4NO30.28%，K2HPO40.04%，MgSO40.05%，蔗糖15%。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法 將配制好的單孢子懸液用玻璃珠打散后，置于85℃的水浴恒溫鍋中恒溫水浴10min，取水浴后的單孢子懸液分裝無菌試管中并編號，分別加入配制好的丙酮助溶的NTG(亞硝基胍)母液，NTG最終濃度為1.00mg/mL，充分混勻后，經35℃、160r/min振蕩處理4min，用Na2S2O3溶液終止反應，冷生理鹽水洗滌2～3次，加入5mL無菌水，稀釋成不同梯度濃度涂布篩選平板，35℃培養(yǎng)4～6d。

1.2.2 亞硝基胍誘變時間的確定 在配制好的黑曲霉單孢子懸液中加入NTG母液，使黑曲霉單孢子懸液中NTG的母液濃度為1mg/mL，混勻后放置，測定不同誘變時間下黑曲霉單孢子懸液的存活率。

1.2.3 突變株篩選方法 經85℃高溫和NTG誘變后的單孢子懸液涂布平板培養(yǎng)4～6d，用接種環(huán)從篩選平板中挑取變色圈直徑(T)與菌落直徑(J)的比值(R)較大的黑曲霉菌株接種斜面，35℃培養(yǎng)4～6d后，用無菌水沖洗斜面接種到搖瓶培養(yǎng)液中(500mL裝液30mL)，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，溫度調節(jié)至35℃，搖床轉速300r/min，振蕩培養(yǎng)4～6d，進行總酸測定，根據出發(fā)菌株平均搖瓶產酸水平9.5%，計算誘變后菌株的產酸增幅。

1.2.4 總酸測定 將發(fā)酵液經脫脂棉過濾后，用定性濾紙過濾，吸取濾清液10mL，置于250mL錐形瓶中，加蒸餾水100mL，并滴加0.5%的酚酞指示劑兩滴，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，記錄所消耗的NaOH的體積為V，計算產酸率。

式(1)中:A是產酸率，%;CNaoH是氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L;M檸是檸檬酸的摩爾質量，g/mol;V是所消耗的NaOH的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 高溫水浴誘變時間的確定

誘變劑量的選擇往往以致死率為依據，若致死率太高，易產生負突變;若致死率太低，則突變較低，適宜的誘變劑量應該選擇在致死率為75%～85%之間，本實驗為了確定85℃的高溫水浴的誘變時間，對高溫水浴的誘變時間和孢子存活率進行了測定，結果見圖1。

圖1 85℃水浴時間對致死率的影響

由圖1可以看出，在85℃時，黑曲霉孢子存活率隨著水浴時間的延長而降低，由圖1數據擬合得到黑曲霉孢子的對數殘留方程:

方程式(2)與對數殘留定律基本一致，這說明黑曲霉孢子在85℃時受熱死亡速率基本符合對數殘留定律，即黑曲霉孢子受熱死亡速率與任何瞬間殘留的活菌數成正比，

由圖1還可以看出，當85℃高溫水浴時間為10min時，存活率約為20%左右，致死率約在80%左右，此時的誘變時間認為是適宜的誘變時間，所以本實驗認為，對于黑曲霉孢子誘變來說，在85℃時高溫水浴時間應為10min左右。

2.2 亞硝基胍誘變時間的確定

由圖2可以看出，黑曲霉孢子的存活率隨誘變時間的延長而降低，對圖2中的數據進行擬合得到方程:

圖2 NTG誘變時間對致死率的影響

方程式(3)說明黑曲霉孢子受NTG致死規(guī)律遵守分子反應速率，基本符合化學反應的一級反應動力學。由圖2還可以看出，當誘變時間為4min時，存活率為25%，致死率約為76%左右，可以認為是適宜的誘變時間，因此，當用濃度為1mg/mL的NTG作誘變劑時，適宜的誘變時間應為4min左右。

2.3 突變株篩選

誘變后菌株的產酸結果見表1。

表1 突變菌株發(fā)酵產酸結果

由表1可以看出，經過復合誘變后挑選的10株黑曲霉突變株中，產酸率都得到了不同程度的提高，其中產酸率最高的為13.76%，增幅可達44.84%，這說明經過85℃高溫和NTG復合誘變，可以明顯提高黑曲霉菌株的生產能力。由表1還可以看出，產酸增幅比較大的黑曲霉菌株往往變色圈直徑(T)與菌落直徑(J)的比值較大，但是并不呈正比關系，這可能與菌種形態(tài)和產孢子能力有一定關系，結合表1產酸結果和實驗過程中對菌株形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，菌落直徑較大，中間凹陷，邊緣不規(guī)則，顏色較淺，孢子較少的菌株，即使變色圈很大，但是搖瓶發(fā)酵效果依然不好。

2.4 突變株穩(wěn)定性考察

從搖瓶產酸結果中篩選出產酸率較高的TN－02、TN－05和TN－10三個菌株，進一步傳代培養(yǎng)，以考察菌株的遺傳穩(wěn)定性，結果見表2。

表2 突變株穩(wěn)定性考察

由表2可以看出，三株高產菌株中，TN－02遺傳比較穩(wěn)定，平均產酸率為13.61%，產酸增幅達到43.2%，TN－10遺傳基本穩(wěn)定，平均產酸率可以達到13.12%，TN－05在傳代5次之后，生產能力有所下降，從第一代的12.95%下降到第五代的12.08%，因此本實驗認為TN－02產酸率較高，穩(wěn)定性能也較好，是一株較優(yōu)良的突變株。

3 結論

通過存活率與誘變時間的測定，確定了黑曲霉單孢子懸液在85℃高溫時適宜的誘變時間為10min，濃度為1mg/mL的亞硝基胍的誘變時間為4min。

采用85℃高溫和亞硝基胍復合誘變對產檸檬酸的黑曲霉菌種進行了誘變，并通過溴甲酚綠平板初篩和搖瓶復篩，篩選出了三株產酸增幅較高的菌株，通過對三株菌株的穩(wěn)定性考察，獲得了一株遺傳性能穩(wěn)定、平均產酸率為13.61%高產菌株TN－02，產酸增幅達到43.2%，說明高溫和亞硝基胍復合誘變對黑曲霉菌種選育來說是一種較好的誘變方法。

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Study on the breeding of citric acid production strains

REN Xiao－li1，2，ZHAO Lin1，*，ZHAO Run－zhu2
(1.School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China;2.Department of Environmental Engineering，Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0151－03

2010－02－23 *通訊聯(lián)系人

任曉莉(1974－)，女，副教授，在職博士后，研究方向:生物化工。