高 光，牟光慶

(大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034)

堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白工藝的研究

高 光，牟光慶*

(大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034)

對(duì)堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的原料預(yù)處理及水解工藝條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，柞蠶絲素蛋白經(jīng)硝酸鈣處理后可明顯提高酶對(duì)其的水解程度。當(dāng)濃度為10g/L時(shí)，堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適條件是:pH9.3，加酶量7.5%，溫度49℃。水解12h時(shí)，柞蠶絲素肽的得率為31.4%。

柞蠶絲素蛋白，堿性蛋白酶，硝酸鈣，水解

Abstract:The tussah fibroin pretreatment and hydrolysis conditions of alkali protease were investigated.The results showed that the hydrolysis degree of alkali protease on tussah fibroin was enhanced obviously after calcium nitrate handling.The optimum hydrolysis conditions were pH9.3，49℃，7.5%content of alkali protease with 10g/L substrate mass concentration for 12h.The yield of tussah fibroin peptide was 31.4%.

Key words:tussah fibroin;alkali protease;calcium nitrate;hydrolysis

柞蠶絲素肽作為一種純天然蛋白質(zhì)，在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用愈來愈受到廣泛關(guān)注。酸法生產(chǎn)絲素肽，雖然可使絲素蛋白水解充分，但會(huì)導(dǎo)致色氨酸全部破壞，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸部分破壞。而堿法能夠引起消旋作用，從而降低絲素肽營養(yǎng)價(jià)值［1］。酶水解反應(yīng)因條件溫和對(duì)氨基酸破壞小而成為降解絲素蛋白的最有前途的方法。酶水解前一般采用不同濃度的 CaCl2溶液或者 CaCl2、C2H5OH、H2O 三元體系處理蛋白質(zhì)［2－4］，其中對(duì)桑蠶絲的鈣鹽處理已有廣泛研究，而對(duì)柞蠶絲鈣鹽處理的研究還比較少［5］。本文對(duì)堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的硝酸鈣處理及水解工藝條件進(jìn)行了研究，以期提高柞蠶絲素肽的得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柞蠶繭殼 由大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院提供;堿性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

722型光柵分光光度計(jì)，精密pH計(jì)，冷凍干燥機(jī)，電熱恒溫水浴鍋，高速離心機(jī)，MWCO14000透析袋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柞蠶絲素肽制備的工藝流程

柞蠶繭殼清洗、剪碎→二次脫膠→絲素蛋白→鹽處理→透析→酶解→滅酶→離心→絲素肽

1.2.2 水解度(DH)的測(cè)定 采用茚三酮法［3］。

式中:h為水解后1g蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù);htot為1g原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù);10.195為1g絲蛋白含有的肽鍵毫摩爾數(shù)(可以由組成該蛋白質(zhì)氨基酸的含量計(jì)算出)。

1.2.3 柞蠶絲素肽得率的測(cè)定 采用質(zhì)量法。

式中:S為絲素肽得率;m1為水解液中可溶性蛋白含量，g;m2為脫膠后絲素蛋白含量，g。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 影響柞蠶絲素蛋白水解度的四個(gè)主要因素為水解時(shí)間、溫度、pH以及加酶量E/S。以水解度為指標(biāo)，通過實(shí)驗(yàn)，確定當(dāng)其他三因素水平一定時(shí)，獲得最大水解度的單因素條件分別為:水解14h;50℃;pH9.5;加酶量10%。由于水解度在水解12h以后基本不再上升，所以正交實(shí)驗(yàn)中水解時(shí)間確定為12h。實(shí)驗(yàn)采用Design－Expert7.1.6系統(tǒng)提供的的Box－Behnken正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)影響因素及水平

2 結(jié)果與分析

Design－Experrt是應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，利用它可以對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合曲線、建立數(shù)學(xué)模型，利用其提供的三維立體圖形，觀察響應(yīng)曲面，獲得實(shí)驗(yàn)最佳條件。

2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

3因素3水平部分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 回歸方程的建立與分析

表3回歸模型方差分析表明，對(duì)DH所建立的回歸模型極顯著(P＜0.01)。決定系數(shù)R2=0.9923，信噪比(Adeq Precision)=23.879，這表明回歸方程的擬合度和可信度均很高，可用于預(yù)測(cè)DH。Y的變異系數(shù)(CV)=1.9%，數(shù)值較低。CV值越低，實(shí)驗(yàn)的可靠性越高，表明本實(shí)驗(yàn)操作可信。

以DH為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design Expert軟件對(duì)表4進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到DH對(duì)編碼自變量A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=9.03－0.34A－0.24B+0.28C+0.2AB+0.23AC+0.12BC－0.97A2－1.22B2－0.89C2

表3 DH回歸模型方差分析

2.3 影響因素的主次關(guān)系

各因素的均方值可以反映出各個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響程度，均方值越大，說明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響程度越大。從表3可知，影響水解度的3個(gè)因素順序是:pH＞加酶量＞溫度。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)中各個(gè)因素之間的交互作用分析

為了觀察pH、溫度、加酶量某兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)DH的影響，現(xiàn)根據(jù)回歸方程繪其對(duì)DH影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖，分別如下:

從圖1中可以看出，當(dāng)水解溫度在50℃左右，pH9.5左右時(shí)，堿性蛋白酶對(duì)柞蠶絲素蛋白的水解作用達(dá)到最大，水解度最高。這是因?yàn)樗庖旱膒H影響底物分子的解離狀態(tài)以及酶活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響酶與底物的結(jié)合和催化作用;在此環(huán)境下酶達(dá)到最適溫度50℃后，溫度繼續(xù)升高，引起酶變性，酶促反應(yīng)速度開始逐步下降。

圖1 Te與pH之間關(guān)系響應(yīng)曲面

從圖2中可以看出，當(dāng)加酶量在7.5%左右，pH9.5左右時(shí)，堿性蛋白酶對(duì)柞蠶絲素蛋白的水解作用達(dá)到最大，水解度最高。酶用量超過7.5%以后，水解度開始下降，這主要是因?yàn)槊笣舛冗^大會(huì)發(fā)生自溶(自水解)現(xiàn)象，導(dǎo)致對(duì)底物水解作用減弱。

圖2 E/S與pH之間的響應(yīng)曲面

從圖3中可以看出，當(dāng)加酶量在7.5%左右，50℃左右時(shí)，堿性蛋白酶對(duì)柞蠶絲素蛋白的水解作用達(dá)到最大，水解度最高。

圖3 E/S與Te之間的響應(yīng)曲面

通過回歸方程，可以得到當(dāng)水解時(shí)間為12h時(shí)，堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適水解條件為:水解溫度48.95℃，pH9.33，加酶量7.5%。該條件下最大水解度為9.09%。

2.5 柞蠶絲素肽的得率

采用上述得到的最適水解條件進(jìn)行水解，將水解液以6000r/min離心10min，上清液冷凍干燥后測(cè)其質(zhì)量。經(jīng)測(cè)定，柞蠶絲素肽的得率為31.4%。由此可見，柞蠶絲素蛋白分別經(jīng)過硝酸鈣和文獻(xiàn)［5－6］中報(bào)道的氯化鈣處理后，再經(jīng)水解作用，絲素肽的得率前者是后者的10倍，本研究較大程度地提高了經(jīng)酶作用后柞蠶絲素肽的得率。

3 結(jié)論

3.1 堿性蛋白酶水解柞蠶絲素蛋白的最適水解條件是:pH9.3，加酶量為7.5%，水解溫度49℃。

3.2 經(jīng)硝酸鈣處理后的柞蠶絲素，明顯提高了酶對(duì)其作用效果，增加了柞蠶絲素肽的得率，水解12h，絲素肽得率達(dá)到31.4%。

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Conditions of alkali protease hydrolyzing tussah fibroin

GAO Guang，MU Guang－qing*
(School of Biology and Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

TS201.2+5

B

1002－0306(2010)08－0245－03

2009－09－02 *通訊聯(lián)系人

高光(1984－)，女，碩士研究生，研究方向:蛋白質(zhì)資源利用。

大連市科技項(xiàng)目(2007B10NC139)。