吳晶 王琪 王佳瑞 張黎川 趙龍

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，而且80%的患者確診時已喪失手術(shù)機會，因此化療在肺癌的治療中具有重要的作用。然而化療耐藥一直是肺癌治療領(lǐng)域的熱點問題，腫瘤耐藥的發(fā)生與腫瘤細胞生存的微環(huán)境密切相關(guān)。由于腫瘤生長迅速，血液供應(yīng)相對不足，產(chǎn)生了低糖、缺氧及酸中毒的微環(huán)境，這種微環(huán)境能夠誘導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein, GRP78）的表達，而GRP78具有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定、保護細胞的作用[1,2]。鈣離子拮抗劑A23187是一種Ca2+轉(zhuǎn)運載體，可以破壞細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子平衡，能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞合成GRP78[3]。有研究[4]表明GRP78在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，并與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性有關(guān)。我們曾對大細胞肺癌、小細胞肺癌中GRP78的表達與VP-16耐藥之間的相關(guān)性進行了研究[5,6]。但關(guān)于GRP78在肺腺癌中的表達情況及其表達是否與腺癌細胞對化療藥物順鉑的耐藥具有相關(guān)性，目前國內(nèi)外研究較少。本研究旨在通過對在誘導(dǎo)劑A23187作用下肺腺癌細胞SPCA-1中GRP78表達水平的檢測及其表達與肺癌細胞對順鉑耐藥的相關(guān)性的分析，探討GRP78在肺腺癌對順鉑耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肺腺癌SPCA-1標(biāo)準(zhǔn)細胞株，購于中科院細胞研究所。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、A23187、順鉑、Trizol（Sigma產(chǎn)品），RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000（Takara產(chǎn)品），羊抗人GRP78抗體、羊抗人β-actin抗體、HRP-兔抗羊IgG（Santa Cruz公司），ECL試劑盒（Amershan公司），MTT（Amresco公司），DMSO 、A23187、順鉑（Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 SPCA-1細胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、飽和濕度37oC的孵箱中培養(yǎng)。將5×104個細胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，再將細胞分為實驗組與對照組，實驗組加入不同濃度A23187（1 μM、2 μM、4 μM、6 μM）；對照組加入PBS，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 RNA提取以及RT-PCR 按試劑盒說明分別提取實驗組和對照組細胞的總RNA，制備cDNA，進行PCR產(chǎn)物擴增。GRP78 mRNA上游引物序列為5' GATAATCAACCAACTGTTAC 3'，下游引物序列為5' GTATCCTCTTCACCAGTTGG 3'，預(yù)計擴增片段長度為577 bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5'TCGTCACCAACTGGGACGACATGG 3'，下游引物序列為5' GATCTTGATCTTCATTGTGCTGGG 3'， 預(yù)計擴增片段長度為750 bp。PCR循環(huán)參數(shù)：94oC預(yù)變性4 min，94oC變性1 min，58oC退火30 s，72oC 延伸30 s，30個循環(huán)，72oC再延伸10 min。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL、PCR引物各1 μL、5×PCR Buffer 10 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、dNTP混合物1 μL、Taq酶0.25 μL。取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3 System進行掃描分析，計算公式為：某樣品GRP78 mRNA的相對表達水平=樣品GRP78的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.3 蛋白提取及Western雜交 將細胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入RIPA緩沖液300 μL，以12 000 rpm速度、4oC離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新管，再重復(fù)離心2次，-70oC保存；Kobayashi等[7]使用Bradford比色法測定蛋白含量，依次進行SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)印。取下轉(zhuǎn)印好的PVDF膜，放入封閉液中4oC封閉過夜，加入稀釋的羊抗人GRP78抗體（一抗，1:400）及羊抗人β-actin（一抗，1:400）， 37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min。再加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG（二抗，1:5 000），37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，在室溫進行ECL顯色。用美國UVP公司EC3 System凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描分析，計算公式為：某樣品GRP78蛋白的相對表達水平=樣品GRP78的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.4 MTT比色法 取對數(shù)生長期的實驗組和對照組SPCA-1細胞，用RPIM-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，置于5 %CO2、飽和濕度的37oC孵箱培養(yǎng)24 h。然后，加入不同濃度的順鉑（0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM），每個濃度設(shè)1個主孔2個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加DMSO溶解甲臢，在酶標(biāo)儀上選擇波長490 nm，檢測各孔OD值，計算細胞生存率及IC50。細胞生存率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%；IC50：使用Bliss法計算；耐藥指數(shù)（resistance index, RI）=IC50實驗組/IC50對照組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗均重復(fù)3次以上，實驗數(shù)據(jù)用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0軟件處理，用單向方差分析比較多組間均數(shù)的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌SPCA-1細胞中GRP78核酸水平的表達 RT-PCR結(jié)果顯示：對照組GRP78核酸的相對表達量為0.165±0.007 3；實驗組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM-6 μM時，GRP78核酸的相對表達量分別為0.495±0.030、0.604±0.031、0.705±0.046 和0.890±0.046；與對照組相比，其表達水平明顯增高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性（圖1）。

2.2 肺腺癌SPCA-1細胞中GRP78蛋白水平的表達 Western雜交結(jié)果顯示：對照組GRP78蛋白的相對表達量為0.304±0.003；實驗組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM-6 μM時，GRP78蛋白的相對表達量分別為0.545±0.004、0.763±0.012、0.864±0.023和0.892±0.034。與對照組相比，其表達水平明顯增高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性（圖2）。

2.3 細胞生存率與GRP78表達的相關(guān)性 不同濃度A23187誘導(dǎo)下細胞對順鉑的IC50值。對照組IC50為5.73±0.43；實驗組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM、2 μM、4 μM、6 μM時，其IC50值分別為：7.06±0.37、4.23±0.17、3.84±0.32和3.03±0.24?？梢娫谙嗤瑵舛软樸K作用下，當(dāng)A23187濃度為2 μM、4 μM、6 μM時，其所對應(yīng)的細胞生存率明顯低于對照組（P＜0.05），且其降低呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性。結(jié)合前述GRP78在核酸和蛋白水平表達的特點，即A23187對GRP78的表達呈濃度依賴性誘導(dǎo)，提示肺腺癌細胞對順鉑的耐藥性與GRP78表達呈負(fù)相關(guān)（圖3）。

圖 1 不同濃度A23187誘導(dǎo)下SPCA-1細胞GRP78核酸水平的表達Fig 1 Expression of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: RT-PCR results of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 mRNA evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

圖 2 不同濃度A23187誘導(dǎo)下SPCA-1細胞GRP78蛋白水平的表達Fig 2 Expression of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: Western blot results of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 protein evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

圖 3 不同濃度A23187誘導(dǎo)下的SPCA-1細胞對順鉑的生存曲線Fig 3 Survival curves of SPCA-1 cells to cisplatin after being induced by A23187 at different concentrations

3 討論

GRP78具有促進錯誤折疊蛋白恢復(fù)正常構(gòu)象、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)Ca2+平衡并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+依賴性蛋白修飾反應(yīng)、對抗氧化應(yīng)激，從而保護細胞的作用[8]。各種應(yīng)激條件如葡萄糖缺乏、蛋白錯誤折疊、蛋白糖基化及一些誘導(dǎo)劑（如Ca2+-ATPase抑制劑thapsigargin）都可以激活GRP78轉(zhuǎn)錄基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP78[3,9,10]。近年來的研究[11]發(fā)現(xiàn)應(yīng)激條件下細胞合成和高度表達GRP78的反應(yīng)，可能是細胞的一種重要防御機制。該機制對細胞具有保護作用，能夠延長在各種不利因素刺激下的細胞生存期[12-14]。而且，GRP78在一些腫瘤細胞中呈高表達，對腫瘤細胞的耐藥性有一定影響。

A23187是一種Ca2+轉(zhuǎn)運載體，作用于細胞后，可使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度（[Ca2+]ER）下降，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]c）增加。因而，可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+失衡，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活GRP78基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP78[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)A23187 可以誘導(dǎo)人大細胞肺癌細胞NCI-H460及人小細胞肺癌細胞NCI-H446 GRP78的表達[5,6]。本研究表明：A23187也可以明顯誘導(dǎo)人肺腺癌SPCA-1細胞GRP78在蛋白及核酸水平的表達。

順鉑屬細胞周期非特異性藥物，其抗癌譜廣，自70年代開始用于臨床以來，已成為治療肺癌、食管癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌等多種惡性腫瘤的一線化療藥物。 本實驗的結(jié)果顯示，當(dāng)A23187濃度為2 μM、4 μM、6 μM時，SPCA-1細胞中GRP78的表達明顯升高，相應(yīng)的細胞在順鉑作用下的生存率卻明顯降低，表明A23187誘導(dǎo)下的GRP78高表達與SPCA-1細胞順鉑耐藥呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，即GRP78高表達能夠提高肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。Mese等[15]通過對人表皮細胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，GRP78表達增高能夠提高野生株A431細胞對順鉑的敏感性，而對耐藥株A431/CDDP2細胞沒有影響。Belfi等[16]利用實驗證明人結(jié)腸癌細胞HCT116、SW480與VACO-8中GRP78的表達增高，可以增強結(jié)腸癌細胞對順鉑的敏感性。Satadal等[17]通過對中國倉鼠V79細胞的研究發(fā)現(xiàn)，在兩種誘導(dǎo)劑6-氨基煙堿與2-脫氧葡萄糖的作用下，GRP78的表達水平均明顯增高，與此相對應(yīng)，V79細胞對順鉑的敏感性亦明顯增強。順鉑主要通過與DNA分子形成鏈內(nèi)或鏈間交叉聯(lián)接或阻止RNA分子再復(fù)制等途徑發(fā)揮抗腫瘤藥理作用，GRP78高表達能夠提高細胞對順鉑的敏感性的機制主要與DNA交聯(lián)修復(fù)有關(guān)。一方面，GRP78能夠減慢DNA交聯(lián)產(chǎn)物從細胞內(nèi)脫失的速度；另一方面，GRP78還能夠削弱DNA加和物切補修復(fù)，從而導(dǎo)致DNA交聯(lián)產(chǎn)物在細胞內(nèi)滯留時間延遲，增強藥物的敏感性[17]。

當(dāng)然，肺癌細胞對順鉑的耐藥是多因素多因子共同參與的復(fù)雜過程，除了細胞微環(huán)境中的GRP78的作用以外，其它機制如藥物流入減少或流出增加、與谷胱甘肽或金屬硫蛋白結(jié)合、機體對藥物的解毒作用增強、DNA修復(fù)以及DNA復(fù)制損傷等也與此相關(guān)。因此，肺癌順鉑耐藥機制值得進一步研究。