張慧君 張雷 王和勇 陳曉峰

在惡性腫瘤中，肺癌仍是目前最常見的死亡原因。許多肺癌患者在就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，據(jù)統(tǒng)計(jì)90%的肺癌患者死亡由轉(zhuǎn)移引起[1]，最近研究[2,3]表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

EMT是指上皮細(xì)胞失去其上皮特征，獲得間質(zhì)特性的過程，它不僅參與胚胎形態(tài)的形成、心臟的發(fā)育和慢性退行性纖維化，而且促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[4]。此外，細(xì)胞外信號(hào)的生長(zhǎng)因子如HGF、EGF、TGF-β、IGF、VEGF等可經(jīng)過不同的信號(hào)通道誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，已證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路參與EMT發(fā)生[5]。本文旨在研究TGF-β1誘導(dǎo)人肺腺癌PC9細(xì)胞發(fā)生EMT及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌PC9細(xì)胞為上海肺科醫(yī)院肺癌免疫研究室常規(guī)傳代培養(yǎng)；TGF-β1購(gòu)自R&D公司；單克隆兔抗人E-cadherin、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG購(gòu)自Abgent公司；F1TC標(biāo)志的羊抗兔IgG購(gòu)自Upstates公司；DMEM購(gòu)自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC9細(xì)胞在37oC、5%CO2、飽和濕度條件下用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、低糖-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至融合70%-80%后，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再加入TGF-β1處理48 h，按實(shí)驗(yàn)要求分組。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將PC9細(xì)胞傳代于6孔板并用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過夜，經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 Western blot檢測(cè) 不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理細(xì)胞48 h后，培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞用4oC的PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管，12 000 rpm離心5 min，棄去上清，將收集到的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液裂解后，取上清液-20oC儲(chǔ)存。上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V電壓使蛋白分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。用單克隆兔抗人的E-cadherin（1:1 000）、單克隆小鼠抗人的Fibronectin和Vimentin（1:100）、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT（1:500）分別與膜接觸4oC孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜5 min×3次，在加辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑在室溫下反應(yīng)1 min后，用X光片曝光，然后定影、顯影。

1.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中預(yù)置的載玻片上，細(xì)胞貼壁爬片，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過夜，加入不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，取出載玻片，用0.4%多聚甲醛固定15 min，加入單克隆兔抗人的E-cadherin（1:200）、單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin（1:50）4oC過夜，加FITC標(biāo)志的羊抗兔IgG和Cy3標(biāo)志的羊抗小鼠IgG（1:50），37oC下孵育1 h，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)PC9細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察 PC9細(xì)胞在不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，通過相差顯微鏡觀察，未處理的PC9細(xì)胞呈不典型上皮細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)TGF-β1刺激后，大部分細(xì)胞形態(tài)明顯拉長(zhǎng)，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，且5 ng/mL TGF-β1組比1 ng/mL組更為明顯。此外，細(xì)胞間連接也變得更疏松（圖1）。

2.2 TGF-β1對(duì)PC9細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理PC9 細(xì)胞48 h后，Western blot顯示TGF-β1并不影響PC9細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin的表達(dá)。然而，間質(zhì)標(biāo)記蛋白Fibronectin的表達(dá)量卻隨TGF-β1濃度的增加也相應(yīng)增加（圖2）。另外通過細(xì)胞免疫熒光也證實(shí)了Western blot的結(jié)果（圖3）。

2.3 TGF-β1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 PC9細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，Western blot顯示P-AKT經(jīng)TGF-β1處理后其表達(dá)量降低，且1 ng/mL組和5 ng/mL組P-AKT表達(dá)量減少大致相仿（圖4）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤進(jìn)展的重要步驟，也是惡性腫瘤患者死亡的重要原因。因此研究腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、提高腫瘤患者生存率至關(guān)重要。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，首先腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，通過血管生成和基底膜重建進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，但進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞必須克服循環(huán)系統(tǒng)的各種障礙才能到達(dá)轉(zhuǎn)移部位。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多種調(diào)控機(jī)制，其中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一就是EMT[6,7]。

Greenburg等[8]指出培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞可獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，最早提出了EMT發(fā)生的證據(jù)。在胚胎形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展及某些纖維化疾病的過程中，TGF-β作為EMT的主要誘導(dǎo)劑備受關(guān)注[9]。TGF-β1作為TGF-β家族的重要成員之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及某些纖維化疾病過程中已被證實(shí)為EMT的主要誘導(dǎo)劑[10-13]。但是，對(duì)人肺腺癌PC9細(xì)胞來說，TGF-β1能否誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生EMT及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路影響又如何？目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

圖 1 PC9細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后的形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Morphologic changes of PC9 cells induced by different concentrations (0 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL) of TGF-β1 for 48 h

圖 2 Western blot檢測(cè)PC9細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)變化Fig 2 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was assessed by Western blot

圖 3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PC9細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)變化Fig 3 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was detected by immunoflurescence staining

圖 4 Western blot檢測(cè)TGF-β1對(duì)PC9細(xì)胞AKT和P-AKT的表達(dá)Fig 4 The expression of AKT and P-AKT in PC9 cells was assessed by Western blot

TGF-β1誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生EMT首先在細(xì)胞形態(tài)方面被證實(shí)[7]。Kasai等[11]指出肺腺癌A549細(xì)胞在TGF-β1作用下，由典型卵石狀的上皮表型轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)表型，同時(shí)相鄰細(xì)胞間連接也變得疏松[11]。Yan等[14]用低氧處理肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞誘導(dǎo)形態(tài)結(jié)果與Kasai 相似。本研究結(jié)果顯示未處理的PC9細(xì)胞呈不典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)TGF-β1處理后大部分細(xì)胞形態(tài)較未處理組明顯拉長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞間連接也變得疏松。為了進(jìn)一步證實(shí)經(jīng)TGF-β1處理的PC9細(xì)胞可發(fā)生EMT，我們首先用Western blot驗(yàn)證EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白，結(jié)果顯示TGF-β1處理PC9細(xì)胞既沒有下調(diào)上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達(dá)，也沒上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin的表達(dá)，僅僅是上調(diào)了間質(zhì)標(biāo)記蛋白Fibronectin的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光也證實(shí)了間質(zhì)標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)上調(diào)。Shintani等[15]指出培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞僅發(fā)生不完全EMT，從嚴(yán)格意義上講我們并不能觀察到真正的EMT[15]。Voulgari等[16]指出發(fā)生不完全EMT的腫瘤細(xì)胞，其分子標(biāo)記物和細(xì)胞特征可發(fā)生不同程度的改變[16]。因此，在本研究中，TGF-β1可誘導(dǎo)肺腺癌PC9細(xì)胞發(fā)生EMT，且為不完全EMT。

TGF-β可通過酪氨酸激酶受體迅速激活PI3K/AKT信號(hào)通路[17,18]。PI3K激酶調(diào)節(jié)亞基已被證實(shí)與TβRI和TβRII受體相關(guān)，并可提高TGF-β的激活效果[19]。PI3K/AKT信號(hào)通路的阻斷可抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并使a-SAM表達(dá)下調(diào)和E-cadherin表達(dá)上調(diào)[20,21]。由此可見，在EMT過程中，TGF-β在PI3K/AKT信號(hào)通路的激活中起重要作用。Chao等[22]指出經(jīng)TGF-β處理的腫瘤細(xì)胞的p-AKT表達(dá)量在4 h時(shí)達(dá)到高峰，之后其表達(dá)量逐漸減低。我們用TGF-β1處理PC9細(xì)胞48 h后p-AKT的表達(dá)量較未處理組明顯減少，而1 ng/mL組和5 ng/mL組的減少量并無(wú)差別，可推測(cè)PC9細(xì)胞在TGF-β1的刺激下，p-AKT的表達(dá)隨時(shí)間的變化而發(fā)生改變，但與TGF-β1濃度關(guān)系不大。

總而言之，TGF-β1可誘導(dǎo)肺腺癌PC9細(xì)胞發(fā)生不完全EMT，并影響PI3K/AKT信號(hào)通路。已證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[23]，那么此通路對(duì)肺腺癌PC9細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力又有何影響，還需進(jìn)一步研究。